Current state of in situ gene expression studiesin animal tissues

Full Text

Молекулярно-генетические методы исследований, в том числе такие как транскриптомные, нашли широкое применение не только в медицине, но и в ветеринарии, где полученные результаты послужили основой для понимания клеточных процессов у сельскохозяйственных животных [1–3]. Существует широкий спектр методов с разной степенью сложности выполнения, с разной производительностью и стоимостью анализа. В настоящее время RNA-seq обладает достаточной разрешающей способностью, благодаря которой можно исследовать транскриптомные различия и изменения на уровне популяций клеток. Однако RNA-seq не позволяет изучить изменения транскриптома единичных клеток. Для данных целей используется группа методов под общим названием scRNA-seq (single-cell RNA sequencing) [4‒8]. Эти методы являются дорогостоящими, требуют высокой квалификации сотрудников лабораторий в области молекулярных технологий и биоинформатики. Более того, они не позволяют изучить популяции клеток и единичные клетки в пространстве по отношению друг к другу, что ведет к потере морфологического контекста клеточного транскриптома [9].

Гибридизация in situ (ISH) – это группа близких по технологии методов для детекции и визуализации специфичных последовательностей нуклеиновых кислот (ДНК, РНК) в срезах тканей, цитологических препаратах и целых организмах [10, 11]. Использование гибридизации in situ ДНК- и РНК-зондов с дальнейшей флуоресцентной микроскопией остается одним из наиболее востребованных и дешевых методов не только в рутинной клинической диагностике [12–15], но и в научных исследованиях [15, 16].

Изначально метод гибридизации РНК in situ (здесь и далее подразумевается изучение траснкриптов in situ, а не использование конкретного типа зондов) проводился с использованием радиоактивно меченных зондов [17], однако в настоящее время для визуализации гибридизации чаще применяются флуоресцентно меченные зонды [10]. Доступны коммерческие наборы для FISH (fluorescent in situ hybridization) анализа РНК, разрабатываемые Advanced Cell Technology, Inc (США) по технологии RNAscope, и на сегодняшний день их используют в большинстве работ [18]. Среди лидеров по коммерческим наборам также можно выделить ViewRNA от Thermo Fisher Scientific (США) [19] и HuluFISH от PixelBiotech (Германия) [20].

В основе разработанной в 2012 г. технологии RNAScope [18] лежат двойные Z-зонды, часть которых предназначена для гибридизации с РНК-мишенью, другая часть – для усиления сигнала, вызывая каскадную реакцию и сводя к минимуму нецелевые сигналы, что приводит к высокоспецифичному окрашиванию (Рис. 1). Стоит отметить, что сама структура ZZ-зондов и последовательности олигонуклеотидов, предоставляемых в наборе, остаются коммерческой тайной. Визуализация окрашивания проводится с помощью флуоресцентного микроскопа или лазерного конфокального микроскопа. В 2019 году максимальное количество одновременно обнаруживаемых РНК-мишеней было увеличено до 12 [21].

 

Рис. 1. Принцип работы технологии RNAscope, использующей ZZ-зонды.

 

Существуют технологии амплификации сигнала с “открытым” принципом работы. Так, используются тирамид-сигнальная амплификация (Рис. 2, а) [22, 23], цепная реакция гибридизации in situ (Рис. 2, б) (hybridization chain reaction) [24], дигоксигенин-меченные зонды [25, 26] с последующей визуализацией флуоресцентно меченных антител к дигоксигенину (также и к другим гаптенам типа биотина) (Рис. 2, в) [27, 28]. Для каждого из этих методов проводятся постоянное усовершенствование и разработка новых протоколов, в том числе и мультиплексирования [29, 30]. Разработаны рекомендации по хранению биоматериала, подлежащего гибридизации РНК in situ, для получения достоверных результатов в ретроспективных исследованиях [31]. Несмотря на то что методы обладают отдельными модификациями, принцип работы – гибридизация нуклеиновых кислот – остается единым [11].

 

Рис. 2. Технологии с “открытым” принципом работы: а – тирамид-сигнальная амплификация; б – цепная реакция гибридизации in situ; в – дигоксигенин-меченные зонды и флуоресцентно меченные антитела.

 

Стоит отметить, что несмотря на общий принцип связывания с таргетными последовательностями способов визуализации результатов гибридизации in situ большое множество. Так, если рассматривать технологии амплификации сигнала с “открытым” принципом работы, то тирамид-сигнальная амплификация требует использования модифицированных зондов, а также антител, связанных с компонентами протекания реакции. В большинстве случаев данная технология позволяет детектировать только один таргет за один анализ, а набор реагентов для протекания тирамидной реакции (без специфичного зонда) может быть использован в разных анализах. В свою очередь, цепная реакция гибридизации не требует никаких вспомогательных компонентов, кроме олигонуклеотидов: один из них таргет-специфичный с “хвостом”, а другие два мечены флюорофорами и амплифицируют сигнал. Это делает анализ более дешевым, позволяет его мультиплексировать, но при этом требует дизайна сложных олигонуклеотидов. Оценка транскриптов in situ при помощи зондов с дигоксигенином и другими гаптенами схожа по использованию антител для визуализации (возможно применение как флуоресцентной визуализации, так и с помощью пероксидазы хрена). Данные методы позволяют проводить как качественную, так и количественную оценку транскриптов in situ, однако количественная оценка требует модификаций изначальных методов исследования [24, 32].

Стоит отметить метод секвенирования, который позволяет извлечь максимальное количество информации о транскриптоме образца без потери морфологического контекста ткани – секвенирование транскриптома in situ [33–35]. Несмотря на то, что технология является передовой, для нее существует ряд значительных ограничений. Поле зрения, т.е. общий размер ткани, которую можно проанализировать в одном эксперименте, в значительной степени определяет масштаб исследования. Это может стать “бутылочным горлышком”, если необходимо профилировать крупные срезы. В то время как существуют коммерчески разрабатываемые ПО, учеными предпринимаются усилия по созданию унифицированных вычислительных open-source программ, однако лаборатория, использующая секвенирование in situ, скорее всего столкнется с необходимостью создания собственного программного обеспечения для выполнения своих задач [36, 37]. Тип фиксации ткани для исследования также требует особого внимания: в большинстве случаев для секвенирования in situ подходят только свежезамороженные ткани [21, 38].

Сопоставление результатов иммуногистохимических (ИГХ) исследований и гибридизации РНК in situ интуитивно, и уже были проведены исследования по сравнению чувствительности и точности этих методик. На клеточных культурах макрофагов из облученных радиацией мышц свиней изучена эффективность связывания антител с CD208 для проведения ИГХ. Исследователями показано, что использование разных антител против одного и того же антигена может привести к невоспроизводимым результатам. Напротив, изучение экспрессии генов с помощью DIG-зондов или цепной реакции гибридизации позволяет получить точные и воспроизводимые результаты [39]. Однако ИГХ и гибридизация РНК in situ не являются взаимозаменяемыми [40], поскольку в анализах используются разные молекулярные мишени. РНК FISH пока не может считаться “золотым стандартом” в гистологических исследованиях ввиду малого количества научно-исследовательских работ с ее использованием [41].

Таким образом, существует разнообразие методов исследований РНК in situ: начиная от простой гибридизации на срезе и заканчивая секвенированием транскриптома in situ. Однако в настоящее время не все из них реализованы в исследованиях сельскохозяйственных животных, особенно это касается передовых технологий оценки транскриптома.

В настоящей работе представлен обзор научных исследований в области транскриптомики in situ у крупного рогатого скота, свиней и кур. Цель данного обзора – показать современное состояние исследований фундаментальных механизмов клеточной регуляции физиологических и патологических процессов у сельскохозяйственных животных. На сегодняшний день существует всего несколько научных направлений в области биологии сельскохозяйственных животных, в рамках которых используется гибридизация РНК in situ. Условно их можно разделить на работы по изучению физиологических процессов и исследования особенностей протекания патологического процесса.

Одно из несвязанных с инфекционным процессом направлений, в котором работает ряд коллективов ученых разных стран, применяя гибридизацию РНК in situ, состоит в изучении кишечника кур во время онтогенеза. В 2020 г. исследовано влияние отсроченного первого кормления (delayed access to feed, DAF) цыплят после вылупления. DAF влияет на массу тела и морфологию кишечника с более выраженным эффектом по мере увеличения его продолжительности. На молекулярном и морфологическом уровнях у цыплят из группы DAF наблюдалось подавление экспрессии мРНК Muc2 и снижение количества бокаловидных клеток в верхней части ворсинок кишечника, в то время как экспрессия мРНК PepT1 повышалась (PepT1 – также известный как SLC15A1 – кодирует белок, ответственный за всасывание ди- и трипептидов). Авторы делают предположение о том, что всасывание кишечником питательных веществ имеет приоритет над защитой организма во время DAF, что может сделать цыпленка более восприимчивым к патогенам в ранний период после вылупления [42]. Другим коллективом авторов были также изучены особенности экспрессии Muc2, но уже в контексте возрастных изменений разных участков тонкого кишечника [43, 44]. Результаты их исследований дают основание предполагать, что при вылуплении цыплят двенадцатиперстная кишка уже обладает устойчивой популяцией бокаловидных клеток, тогда как популяции этих клеток в тощей и подвздошной кишках еще претерпевают изменения в период раннего онтогенеза. Авторы объясняют это тем, что двенадцатиперстная кишка является первым участком кишечника, который сталкивается с патогенами; таким образом, наличие хорошо развитой слизистой является необходимым условием для реализации барьерной функции кишечника цыплят. В 2021 г. было впервые проведено исследование эффекта жирных кислот на иммунные аспекты кишечника с помощью технологий RNAscope и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), что позволило детально изучить вопросы, касающиеся роли кислот в иммунной модуляции на тканевом и клеточном уровнях. Проведенное исследование на основе морфологических и транскриптомных результатов позволяет аргументировать подбор оптимальных кормовых добавок для здорового развития бройлеров [45].

Израильскими учеными проведена серия работ [46–48]по изучению влияния разных режимов кормления и составов рационов на развитие тонкого кишечника цыплят. В работах были использованы наборы RNAscope для флуоресцентной гибридизации РНК in situ Lgr5 (как маркер стволовых клеток) и PepT1 (как маркер энтероцитов, способных к абсорбции). В ИГХ исследованиях использованы следующие мишени: Sox9 – как маркер прогениторных клеток; PCNA – как маркер пролиферирующих клеток. Был доказан положительный эффект кормления сразу после вылупления цыплят на созревание эпителиальных клеток [46]. Этой же группой ученых исследован пролиферативный эффект инъекций in-ovo растворами аминокислот на клетки тонкого кишечника. Несмотря на то что положительный эффект нивелировался после вылупления цыплят, как утверждают авторы, данное исследование является информативным для понимания влияния разных аминокислот на дифференциацию и пролиферацию прогениторных клеток кишечника [47]. На основании этих данных учеными были проведены дальнейшие исследования влияний in ovo инъекций растворов L-глутамина на развитие тонкого кишечника эмбрионов кур [48], в том числе и на экспрессию гена LGR5 (маркера стволовых клеток кишечника), для которого детекция с помощью RNAscope ранее была продемонстрирована [49]. Стимуляция L-глутамином повышала экспрессию мРНК переносчиков питательных веществ PepT-1 и SGLT-1 и белков плотных контактов TJP-1 и TJP-2 до и после вылупления цыплят. Поскольку сигналинг глюкагоноподобного белка-2 от кишечных эндокринных L-клеток связан с развитием и функционированием энтероцитов, был исследован эффект стимуляции глутамина на экспрессию мРНК ключевых гормонов и рецепторов в рамках этого энтероэндокринного пути и было обнаружено значительное увеличение экспрессии GLP-2R (кодирует рецептор глюкагоноподобого белка-2), IGF-1 и IGF-1R (кодируют инсулиноподобный фактор роста-1 и его рецептор соответственно) до и после вылупления цыплят [49].

Работ по другим направлениям исследований, несвязанных с инфекционным процессом и объединенных одной темой, крайне мало. В 2020 г. китайскими учеными проведено секвенирование РНК единичных клеток (scRNA-seq) с целью обнаружить новые гены-маркеры внутримышечных адипоцитов. Кластеризация единичных клеток по транскриптомам показала наличие обособленного кластера с высоким уровнем экспрессии гена ADIPOQ, на основании чего был сделан вывод о том, что это кластер ADIPOQ⁺-адипоцитов. В результате анализа исследователями обнаружены два новых гена-кандидата внутримышечных жировых клеток: APOA1 и COL1A1. Для валидации маркеров использовали RNAscope, и таким образом была доказана специфичность двух новых биомаркеров для дальнейших исследований гетерогенной структуры мышц кур [50].

Методы гибридизации РНК in situ позволяют не только определять специфичный для конкретных популяций клеток профиль экспрессируемых генов, но и изучать сложные транскриптомные взаимодействия. Так, в 2019 г. китайскими исследователями доказано, что обнаруженная ими ранее lncRNA (длинная некодирующая РНК) IMFNCR является “губкой” для miR-128-3p и miR-27b-3p (miR – микроРНК), которые, в свою очередь, являются ингибиторами экспрессии PPARG (PPARG – гамма-рецептор, активируемый пролифератором пероксисом, ключевой фактор транскрипции для регуляции липидного обмена и дифференциации преадипоцитов). Таким образом, c помощью набора детекции РНК in situ RiboBio (Guangzhou RiboBio Co., Китай) сделан вывод о том, что уровень экспрессии lncRNA IMFNCR это маркер дифференциации преадипоцитов во внутримышечной жировой ткани [51], количество которой является показателем качества куриного мяса [52].

В производстве куриного мяса качество получаемой продукции является определяющий фактор эффективности производства. Например, существует такая проблема как синдром “деревянной грудки” – дефект качества мяса, наносящий экономический ущерб птицеводству [53, 54]. В 2019 г. была исследована взаимосвязь между изменениями в метаболизме липидов, появлением медленных изоформ миофибрилл в мышцах Pectoralis major у коммерческих цыплят-бройлеров с развитием “деревянной грудки”. С помощью гибридизации РНК in situ установлена повышенная экспрессия гена липопротеинлипазы в венозном русле пораженных цыплят. Повышенный уровень экспрессии данного фермента, в свою очередь, способствует повышенной проницаемости венозного эндотелия для свободных жирных кислот и остатков липопротеинов, что приводит к развитию очага лимфоцитарного флебита. Авторами тем же методом исследованы потенциальные гены-маркеры развития “деревянной грудки”, демонстрирующие повышенную экспрессию: MYBPC1, кодирующий миозин-связывающий белок C, участвующий в поддержании структуры саркомера, и CSRP3, белок которого играет роль в передаче механосенсорных сигналов. Однако более подробные исследования ассоциированных с этими маркерами процессов еще предстоят [55].

Проводимые исследования с использованием кур в качестве модельных объектов не ограничиваются работами по продуктивности [56, 57]. В 2016 г. европейскими учеными изучена зависимость пролиферации и дифференциации клеток головного мозга от экспрессии генов регуляторов обмена тиреоидных гормонов в развивающемся мозжечке эмбрионов кур [58]. В ряде работ показаны клеточные и тканевые паттерны экспрессии транспортеров и дейодиназ тиреоидных гормонов в мозжечке эмбрионов, а также общая картина зависимости развития от них у нескольких типов клеток (в том числе клеток Пуркинье) уже в раннем эмбриогенезе [58–60]. Изучены особенности развития ренин-ангиотензиновой системы во время эмбриогенеза и раннего постнатального онтогенеза цыплят. Показано, что ренин экспрессируется в ренальных и экстраренальных структурах, но с возрастом (30 дней после вылупления) обнаруживается только в юкстагломерулярных клеточных областях почек [26]. Эмбрионы кур являются удобным материалом для изучения процессов роста и развития разных тканей и органов, и протоколы для проведения более высокопроизводительных исследований продолжают разрабатываться. Так, была показана адаптация методики повышения оптической прозрачности тотальных препаратов эмбрионов кур с использованием мультиплексной иммуногистохомии и гибридизации РНК in situ [61].

К сожалению, на сегодняшний день проведено мало работ по изучению пространственных транскриптомных особенностей других сельскохозяйственных животных.

Особенности транскриптомики отдельных клеток кишечника представляют интерес не только на курах в качестве модельного объекта. Проведенный в 2022 г. транскриптомный анализ с высоким разрешением показал транскрипционную изолированность для иммунных и эпителиальных клеток тонкого кишечника человека и свиньи [62]. Это первое исследование с помощью scRNA-seq, в котором выявлены транскрипционные различия между интраэпителиальными и субэпителиальными лимфоцитами у свиней. С использованием секвенирования транскриптома единичных клеток таких различий обнаружено не было, поскольку необходимо изолирование лимфоцитов разных слоев кожи [63]. Исследования по транскрипционным различиям интраэпителиальных и субэпителиальных лимфоцитов у свиней in situ с помощью методов гибридизации РНК до сих пор не проведены.

В 2018 г. корейские ученые исследовали экспрессию генов, отвечающих за различные биологические процессы, специфичные для эндометрия, яичников и яйцеводов свиней. Были проведены секвенирование транскриптома и валидация результатов с помощью ОТ-ПЦР с последующей гибридизацией РНК in situ для потенциальных биомаркеров тканеспецифичных процессов. В качестве таких маркеров были идентифицированы следующие гены: CYP7A1, CYP17A1 и CYP19A1, обеспечивающие биосинтез стероидов и локализующиеся в тканях яичников; PTGS2 и PTGER2 – ассоциированы с метаболизмом эйкозаноидов, специфичных для тканей эндометрия. Отмечен высокий уровень экспрессии мРНК CYP7A1 и CYP19A1 в фолликулах яичников в клетках гранулезы, в то время как мРНК CYP17A экспрессируется в основном в тека-клетках яичников. Экспрессия данных маркеров указывает на то, что стероидогенная активность в яичниках опосредована действием тека-клеток и клеток гранулезы. Уровни экспрессии мРНК CYP17A1 и CYP19A1 во время фазы проэструса были высокими. Экспрессия генов PTGS2 и PTGER2 в эндометрии обнаружена в эпителиальных и стромальных клетках с выраженной интенсивностью сигнала в фазе позднего диэструса и проэструса. Можно предположить, что действие простагландинов на эндометрий может иметь решающее значение для функции эндометрия и эстральной цикличности. Авторы считают, что дальнейшие исследования должны быть направлены на выяснение молекулярных функций данных генов для их дальнейшего использования в качестве молекулярных маркеров клеток и тканей [64].

Комплекс методов, включающий гибридизацию РНК in situ, иммуногистохимию и радиоиммуноанализ, использован для изучения связи функций нейроэндокринной системы и фертильности молочных коров. Исследован уровень экспрессии мРНК гипоталамического нейропептида Kiss1, который стимулирует секрецию гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ) и опосредует эффекты обратной связи половых стероидов на секрецию ГнРГ в дугообразном ядре гипоталамуса. Установлено, что снижение экспрессии Kiss1 может являться фактором снижения фертильности коров [65].

B.T. Mohammed и F.X. Donadeu с помощью гибридизации РНК in situ изучили экспрессию miR-202 в клетках Сертоли и гоноцитах в семенниках быков. Результаты исследования показали изменения в экспрессии miR-202 на разных стадиях развития гоноцитов во время сперматогенеза. Уровень экспрессии miR-202 был выше в сперматогониях и первичных сперматоцитах, расположенных вблизи базального отдела семенных канальцев, по сравнению со вторичными сперматоцитами и сперматидами. Используя доступные базы данных о микроРНК, для miR-202 идентифицировано в общей сложности 466 предполагаемых генов-мишеней (в том числе мишень рапамицина – mTOR), что дает основания предполагать ключевую роль miR-202 в регуляции созревания и жизнеспособности гоноцитов в семенниках быков [66], а также ее роль в регуляции первого деления зиготы [67].

В 2020 г. китайскими учеными проведено комплексное исследование роли lncRNA LncIMF4 во внутримышечном адипогенезе у преадипоцитов с использованием секвенирования транскриптома и гибридизации РНК in situ. Авторы утверждают, что нокдаун LncIMF4 малой интерферирующей РНК стимулирует пролиферацию и дифференцировку внутримышечных адипоцитов свиней, поскольку происходит ослабление процессов аутофагии внутриклеточных липидов [68]. Сравнительные исследования энтеральной нервной системы человека и подсвинков с помощью секвенирования транскриптома позволили идентифицировать среди картированных клеток три основные нейрональные (холин-, NO- и глутаматергические) и две глиальные субпопуляции, их дискриминационные маркерные гены были валидизированы с помощью RNAscope [69].

В доступных источниках литературы не найдено комплексных работ с использованием методов гибридизации РНК in situ, посвященных изучению видовых транскриптомных различий сельскохозяйственных животных и птицы. Существуют работы, в которых изучены процессы, подробно описанные у других животных (например, крыс и мышей), а также атласы, посвященные изучению паттернов экспрессии эмбрионов мышей [70], все те же аспекты еще предстоит исследовать у продуктивных животных. Например, лептин и фактор некроза опухолей являются взаимосвязанными адипокинами, однако на основании полученных результатов по FISH-TSA картированию генов, ИГХ и ОТ-ПЦР в 2019 г. сделано предположение, что роль в качестве адипокина для фактора некроза опухолей может быть свойственна только млекопитающим [23]. Впервые в 2017 г. для кур были подробно изучены особенности экспрессии панкреатических полипептидов в зависимости от режима и рациона питания [71]. На сегодняшний день не существует исследований с использованием, например, одной группы генов в разрезе их пространственных особенностей расположения и клеточной принадлежности для разных видов животных. Известно только одно исследование различий в регуляции и организации внеклеточного матрикса (гиалуроновая кислота и коллаген) яичников крупного рогатого скота и свиней. Однако при проведении оценки уровня экспрессии генов, участвующих в синтезе коллагена (Col3a1, Col1a1), генов гиалуронидаз (Hyal1, Hyal2, Tmem2 и Kiaa1199) и синтаз гиалуронана (Has1, Has2, Has3), как утверждают сами авторы, экспериментальная выборка была слишком мала, чтобы сделать окончательные выводы об их свойствах, а РНК FISH для одной из гиалуронидаз был проведен только на мышах [72]. Только в 2019 г. изучены особенности пространственной экспрессии гена лептина и его рецепторов в коже крупного рогатого скота. Показано, что адипоциты отсутствуют около волосяных фолликулов [73]. Напротив, в исследовании кожи собак обнаружена экспрессия молекул лептина около волосяных фолликулов, а также рецепторов лептина на клетках сальных желез [74], что свидетельствует о морфологических различиях в структуре волосистой части кожи разных видов. Уже известно, что у человека белая жировая ткань кожи играет паракринную роль в росте и развитии волосяных фолликулов, однако некоторые механизмы путей этого сигналинга не изучены. Например, как адипокины влияют на секретируемый кожной белой жировой тканью фактор роста гепатоцитов, который, в конечном счете, оказывает влияние на рост волосяных фолликулов [75]. Учитывая транскриптомные различия в структуре тканей кожи разных видов, имеются основания предполагать отсутствие паракринного контроля адипозной тканью развития волосяных фолликулов у крупного рогатого скота.

Одним из перспективных направлений использования гибридизации РНК in situ является изучение пространственной экспрессии генов для понимания процессов структурно-функциональной дегенерации тканей [76], испытывающих нагрузку при метаболических дисбалансах, связанных с промышленным содержанием продуктивных животных. В данной области использование методов пространственной транскриптомики и метаболомики еще предстоит для ряда маркеров и процессов (инсулин-инсулиноподобный сигналинг, мишень рапамицина, сигнальные пути MAPK, сиртуины, рецепторы PPAR, бета-галактозидаза и другие) [77–80]. Такие исследования позволят по-новому взглянуть на физиологические и патологические процессы метаболического старения тканей.

Еще одним методом исследования пространственной экспрессии генов является секвенирование РНК in situ [81–83]. В сельскохозяйственной биологии количество таких работ крайне мало. Группой исследователей из КНР проведено транскриптомное исследование мышечной и жировой ткани свиней. Использованы секвенирование транскриптома единичных клеток и анализ пространственной экспрессии с помощью Visium (10× Genomics Inc, США). Определены особенности миофибрилльного состава мышц. В результате работы охарактеризована транскриптомная изменчивость и идентифицированы молекулярные механизмы, лежащие в основе экономически ценных признаков у свиней. Помимо новых, ранее неизученных транскриптов (в том числе транскриптов с неопределенным кодирующим потенциалом, микроРНК, кольцевых РНК, длинных некодирующих РНК), исследователями обнаружено, что более глубокие слои скелетной мышечной ткани (участвуют в поддержании положения тела), характеризующиеся быстрым окислительным метаболизмом, имели больше мРНК миофибрилл I типа по сравнению с поверхностными слоями (участвуют в быстрых движениях), которые содержат больше мРНК миофибрилл IIB типа [84]. В другом исследовании с помощью секвенирования транскриптома in situ (Visium, 10× Genomics Inc.), секвенирования единичных клеток и валидации генов-маркеров цепной реакцией гибридизации v3.0 [24] изучен эмбриогенез сердечной мышцы цыплят на нескольких сроках развития. Результаты комплексного подхода в секвенировании клеток были валидированы с помощью ИГХ и гибридизации РНК in situ, что позволило исследователям предположить участие клеток эпикардиального происхождения в регуляции экспрессии ключевых генов белков внеклеточного матрикса, вовлеченных в миграции клеток [85].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время представлено ограниченное количество работ по исследованию экспрессии генов in situ не только в Российской Федерации, но и за рубежом. В отечественной ветеринарной медицине подобных работ не проводилось. В связи с этим большой объем фундаментальных знаний, полученный секвенированием транскриптома, остается невоспроизведенным с помощью гистологических методик. Такое последовательное комплексное воспроизведение результатов секвенирования реализуется, но недостаточно распространено.

К сожалению, на сегодняшний день проведено мало исследований по изучению пространственных транскриптомных особенностей сельскохозяйственных животных. Несмотря на разнообразие доступных технологий и их постоянное совершенствование, у свиней и крупного рогатого скота более детальные исследования экспрессии генов еще предстоят.

Также актуальным является изучение течения инфекционного процесса с точки зрения экспрессии генов противо- и провоспалительных маркеров в различных тканях.

Таким образом, представляется перспективной разработка отечественной технологии для оценки уровня экспрессии in situ с использованием гибридизационных зондов по технологии, принцип работы которой находился бы в открытом доступе. На сегодняшний день подобные разработки с использованием новых доступных химических компонентов в России отсутствуют, как и коммерческие наборы для проведения данного анализа.

Работа выполнена в рамках Государственного задания Минобрнауки России по теме № 0532-2022-0004 “Разработка технологии для маркер-ориентированной селекции крупного рогатого скота по генам, ассоциированным с устойчивостью к заболеваниям”.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

About the authors

M. V. Bytov

Ural Federal Agrarian Scientific Research Centre, Ural Branch of Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: nauka_sokolova@mail.ru
Russian Federation, Ekaterinburg

V. D. Zubareva

Ural Federal Agrarian Scientific Research Centre, Ural Branch of Russian Academy of Sciences

Email: nauka_sokolova@mail.ru
Russian Federation, Ekaterinburg

S. V. Volskaya

Ural Federal Agrarian Scientific Research Centre, Ural Branch of Russian Academy of Sciences

Email: nauka_sokolova@mail.ru
Russian Federation, Ekaterinburg

S. L. Khatsko

Ural Federal Agrarian Scientific Research Centre, Ural Branch of Russian Academy of Sciences; Yeltsin Ural Federal University

Email: nauka_sokolova@mail.ru
Russian Federation, Ekaterinburg; Ekaterinburg

I. A. Shkuratova

Ural Federal Agrarian Scientific Research Centre, Ural Branch of Russian Academy of Sciences

Email: nauka_sokolova@mail.ru
Russian Federation, Ekaterinburg

O. V. Sokolova

Ural Federal Agrarian Scientific Research Centre, Ural Branch of Russian Academy of Sciences

Email: nauka_sokolova@mail.ru
Russian Federation, Ekaterinburg

References

Supplementary files