Современное состояние исследований экспрессии генов in situ в тканях животных

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Морфологические исследования сельскохозяйственных животных чаще всего проводятся с использованием простейших методик приготовления и окраски препаратов. Изучение процессов эмбриогенеза, постэмбриональных особенностей развития органов и тканей, эффекта влияния различных веществ с использованием гистохимических и иммуногистохимических методов окраски, а также с помощью гибридизации РНК in situ и секвенированием транскриптома in situ еще предстоит. Особенности протекания многих клеточных и тканевых процессов у крупного рогатого скота, свиней и кур в разрезе сравнительной физиологии еще не изучены. Высокая продуктивность сельскохозяйственных животных ассоциирована с интенсивным функционированием всех органов и систем организма. Влияние промышленного содержания сельскохозяйственных животных и его последствия на развитие организма в онтогенезе заслуживают отдельного направления исследований с точки зрения экспрессии генов in situ. Несмотря на стремительное развитие технологий секвенирования транскриптома, в результате использования которых открываются новые гены-кандидаты какого-либо процесса, гибридизация РНК in situ остается “золотым” стандартом для их валидации. В настоящем обзоре кратко представлены современные методики и их модификации для изучения экспрессии генов in situ. Методики изучения транскриптома, которые реализованы на крупном рогатом скоте, свиньях и курах в качестве модельных организмов, включают: гибридизацию РНК in situ с использованием ZZ-зондов, тирамид-сигнальную амплификацию, цепную реакцию гибридизации, дигоксигенин-меченные зонды, ОТ-ПЦР, секвенирование транскриптома единичных клеток, секвенирование РНК in situ. В настоящем обзоре рассмотрены результаты исследований на крупном рогатом скоте, свиньях и курах. Результаты исследований в данной области представляются актуальными для понимания особенностей механизмов адаптации на транскриптомном уровне у высокопродуктивных животных в условиях промышленного содержания для поиска новых маркеров ценных сельскохозяйственных признаков. Стоит отметить, что в современной отечественной и зарубежной литературе крайне мало исследований с помощью гибридизации РНК in situ, несмотря на доступность и простоту метода.

Полный текст

Молекулярно-генетические методы исследований, в том числе такие как транскриптомные, нашли широкое применение не только в медицине, но и в ветеринарии, где полученные результаты послужили основой для понимания клеточных процессов у сельскохозяйственных животных [1–3]. Существует широкий спектр методов с разной степенью сложности выполнения, с разной производительностью и стоимостью анализа. В настоящее время RNA-seq обладает достаточной разрешающей способностью, благодаря которой можно исследовать транскриптомные различия и изменения на уровне популяций клеток. Однако RNA-seq не позволяет изучить изменения транскриптома единичных клеток. Для данных целей используется группа методов под общим названием scRNA-seq (single-cell RNA sequencing) [4‒8]. Эти методы являются дорогостоящими, требуют высокой квалификации сотрудников лабораторий в области молекулярных технологий и биоинформатики. Более того, они не позволяют изучить популяции клеток и единичные клетки в пространстве по отношению друг к другу, что ведет к потере морфологического контекста клеточного транскриптома [9].

Гибридизация in situ (ISH) – это группа близких по технологии методов для детекции и визуализации специфичных последовательностей нуклеиновых кислот (ДНК, РНК) в срезах тканей, цитологических препаратах и целых организмах [10, 11]. Использование гибридизации in situ ДНК- и РНК-зондов с дальнейшей флуоресцентной микроскопией остается одним из наиболее востребованных и дешевых методов не только в рутинной клинической диагностике [12–15], но и в научных исследованиях [15, 16].

Изначально метод гибридизации РНК in situ (здесь и далее подразумевается изучение траснкриптов in situ, а не использование конкретного типа зондов) проводился с использованием радиоактивно меченных зондов [17], однако в настоящее время для визуализации гибридизации чаще применяются флуоресцентно меченные зонды [10]. Доступны коммерческие наборы для FISH (fluorescent in situ hybridization) анализа РНК, разрабатываемые Advanced Cell Technology, Inc (США) по технологии RNAscope, и на сегодняшний день их используют в большинстве работ [18]. Среди лидеров по коммерческим наборам также можно выделить ViewRNA от Thermo Fisher Scientific (США) [19] и HuluFISH от PixelBiotech (Германия) [20].

В основе разработанной в 2012 г. технологии RNAScope [18] лежат двойные Z-зонды, часть которых предназначена для гибридизации с РНК-мишенью, другая часть – для усиления сигнала, вызывая каскадную реакцию и сводя к минимуму нецелевые сигналы, что приводит к высокоспецифичному окрашиванию (Рис. 1). Стоит отметить, что сама структура ZZ-зондов и последовательности олигонуклеотидов, предоставляемых в наборе, остаются коммерческой тайной. Визуализация окрашивания проводится с помощью флуоресцентного микроскопа или лазерного конфокального микроскопа. В 2019 году максимальное количество одновременно обнаруживаемых РНК-мишеней было увеличено до 12 [21].

 

Рис. 1. Принцип работы технологии RNAscope, использующей ZZ-зонды.

 

Существуют технологии амплификации сигнала с “открытым” принципом работы. Так, используются тирамид-сигнальная амплификация (Рис. 2, а) [22, 23], цепная реакция гибридизации in situ (Рис. 2, б) (hybridization chain reaction) [24], дигоксигенин-меченные зонды [25, 26] с последующей визуализацией флуоресцентно меченных антител к дигоксигенину (также и к другим гаптенам типа биотина) (Рис. 2, в) [27, 28]. Для каждого из этих методов проводятся постоянное усовершенствование и разработка новых протоколов, в том числе и мультиплексирования [29, 30]. Разработаны рекомендации по хранению биоматериала, подлежащего гибридизации РНК in situ, для получения достоверных результатов в ретроспективных исследованиях [31]. Несмотря на то что методы обладают отдельными модификациями, принцип работы – гибридизация нуклеиновых кислот – остается единым [11].

 

Рис. 2. Технологии с “открытым” принципом работы: а – тирамид-сигнальная амплификация; б – цепная реакция гибридизации in situ; в – дигоксигенин-меченные зонды и флуоресцентно меченные антитела.

 

Стоит отметить, что несмотря на общий принцип связывания с таргетными последовательностями способов визуализации результатов гибридизации in situ большое множество. Так, если рассматривать технологии амплификации сигнала с “открытым” принципом работы, то тирамид-сигнальная амплификация требует использования модифицированных зондов, а также антител, связанных с компонентами протекания реакции. В большинстве случаев данная технология позволяет детектировать только один таргет за один анализ, а набор реагентов для протекания тирамидной реакции (без специфичного зонда) может быть использован в разных анализах. В свою очередь, цепная реакция гибридизации не требует никаких вспомогательных компонентов, кроме олигонуклеотидов: один из них таргет-специфичный с “хвостом”, а другие два мечены флюорофорами и амплифицируют сигнал. Это делает анализ более дешевым, позволяет его мультиплексировать, но при этом требует дизайна сложных олигонуклеотидов. Оценка транскриптов in situ при помощи зондов с дигоксигенином и другими гаптенами схожа по использованию антител для визуализации (возможно применение как флуоресцентной визуализации, так и с помощью пероксидазы хрена). Данные методы позволяют проводить как качественную, так и количественную оценку транскриптов in situ, однако количественная оценка требует модификаций изначальных методов исследования [24, 32].

Стоит отметить метод секвенирования, который позволяет извлечь максимальное количество информации о транскриптоме образца без потери морфологического контекста ткани – секвенирование транскриптома in situ [33–35]. Несмотря на то, что технология является передовой, для нее существует ряд значительных ограничений. Поле зрения, т.е. общий размер ткани, которую можно проанализировать в одном эксперименте, в значительной степени определяет масштаб исследования. Это может стать “бутылочным горлышком”, если необходимо профилировать крупные срезы. В то время как существуют коммерчески разрабатываемые ПО, учеными предпринимаются усилия по созданию унифицированных вычислительных open-source программ, однако лаборатория, использующая секвенирование in situ, скорее всего столкнется с необходимостью создания собственного программного обеспечения для выполнения своих задач [36, 37]. Тип фиксации ткани для исследования также требует особого внимания: в большинстве случаев для секвенирования in situ подходят только свежезамороженные ткани [21, 38].

Сопоставление результатов иммуногистохимических (ИГХ) исследований и гибридизации РНК in situ интуитивно, и уже были проведены исследования по сравнению чувствительности и точности этих методик. На клеточных культурах макрофагов из облученных радиацией мышц свиней изучена эффективность связывания антител с CD208 для проведения ИГХ. Исследователями показано, что использование разных антител против одного и того же антигена может привести к невоспроизводимым результатам. Напротив, изучение экспрессии генов с помощью DIG-зондов или цепной реакции гибридизации позволяет получить точные и воспроизводимые результаты [39]. Однако ИГХ и гибридизация РНК in situ не являются взаимозаменяемыми [40], поскольку в анализах используются разные молекулярные мишени. РНК FISH пока не может считаться “золотым стандартом” в гистологических исследованиях ввиду малого количества научно-исследовательских работ с ее использованием [41].

Таким образом, существует разнообразие методов исследований РНК in situ: начиная от простой гибридизации на срезе и заканчивая секвенированием транскриптома in situ. Однако в настоящее время не все из них реализованы в исследованиях сельскохозяйственных животных, особенно это касается передовых технологий оценки транскриптома.

В настоящей работе представлен обзор научных исследований в области транскриптомики in situ у крупного рогатого скота, свиней и кур. Цель данного обзора – показать современное состояние исследований фундаментальных механизмов клеточной регуляции физиологических и патологических процессов у сельскохозяйственных животных. На сегодняшний день существует всего несколько научных направлений в области биологии сельскохозяйственных животных, в рамках которых используется гибридизация РНК in situ. Условно их можно разделить на работы по изучению физиологических процессов и исследования особенностей протекания патологического процесса.

Одно из несвязанных с инфекционным процессом направлений, в котором работает ряд коллективов ученых разных стран, применяя гибридизацию РНК in situ, состоит в изучении кишечника кур во время онтогенеза. В 2020 г. исследовано влияние отсроченного первого кормления (delayed access to feed, DAF) цыплят после вылупления. DAF влияет на массу тела и морфологию кишечника с более выраженным эффектом по мере увеличения его продолжительности. На молекулярном и морфологическом уровнях у цыплят из группы DAF наблюдалось подавление экспрессии мРНК Muc2 и снижение количества бокаловидных клеток в верхней части ворсинок кишечника, в то время как экспрессия мРНК PepT1 повышалась (PepT1 – также известный как SLC15A1 – кодирует белок, ответственный за всасывание ди- и трипептидов). Авторы делают предположение о том, что всасывание кишечником питательных веществ имеет приоритет над защитой организма во время DAF, что может сделать цыпленка более восприимчивым к патогенам в ранний период после вылупления [42]. Другим коллективом авторов были также изучены особенности экспрессии Muc2, но уже в контексте возрастных изменений разных участков тонкого кишечника [43, 44]. Результаты их исследований дают основание предполагать, что при вылуплении цыплят двенадцатиперстная кишка уже обладает устойчивой популяцией бокаловидных клеток, тогда как популяции этих клеток в тощей и подвздошной кишках еще претерпевают изменения в период раннего онтогенеза. Авторы объясняют это тем, что двенадцатиперстная кишка является первым участком кишечника, который сталкивается с патогенами; таким образом, наличие хорошо развитой слизистой является необходимым условием для реализации барьерной функции кишечника цыплят. В 2021 г. было впервые проведено исследование эффекта жирных кислот на иммунные аспекты кишечника с помощью технологий RNAscope и полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), что позволило детально изучить вопросы, касающиеся роли кислот в иммунной модуляции на тканевом и клеточном уровнях. Проведенное исследование на основе морфологических и транскриптомных результатов позволяет аргументировать подбор оптимальных кормовых добавок для здорового развития бройлеров [45].

Израильскими учеными проведена серия работ [46–48]по изучению влияния разных режимов кормления и составов рационов на развитие тонкого кишечника цыплят. В работах были использованы наборы RNAscope для флуоресцентной гибридизации РНК in situ Lgr5 (как маркер стволовых клеток) и PepT1 (как маркер энтероцитов, способных к абсорбции). В ИГХ исследованиях использованы следующие мишени: Sox9 – как маркер прогениторных клеток; PCNA – как маркер пролиферирующих клеток. Был доказан положительный эффект кормления сразу после вылупления цыплят на созревание эпителиальных клеток [46]. Этой же группой ученых исследован пролиферативный эффект инъекций in-ovo растворами аминокислот на клетки тонкого кишечника. Несмотря на то что положительный эффект нивелировался после вылупления цыплят, как утверждают авторы, данное исследование является информативным для понимания влияния разных аминокислот на дифференциацию и пролиферацию прогениторных клеток кишечника [47]. На основании этих данных учеными были проведены дальнейшие исследования влияний in ovo инъекций растворов L-глутамина на развитие тонкого кишечника эмбрионов кур [48], в том числе и на экспрессию гена LGR5 (маркера стволовых клеток кишечника), для которого детекция с помощью RNAscope ранее была продемонстрирована [49]. Стимуляция L-глутамином повышала экспрессию мРНК переносчиков питательных веществ PepT-1 и SGLT-1 и белков плотных контактов TJP-1 и TJP-2 до и после вылупления цыплят. Поскольку сигналинг глюкагоноподобного белка-2 от кишечных эндокринных L-клеток связан с развитием и функционированием энтероцитов, был исследован эффект стимуляции глутамина на экспрессию мРНК ключевых гормонов и рецепторов в рамках этого энтероэндокринного пути и было обнаружено значительное увеличение экспрессии GLP-2R (кодирует рецептор глюкагоноподобого белка-2), IGF-1 и IGF-1R (кодируют инсулиноподобный фактор роста-1 и его рецептор соответственно) до и после вылупления цыплят [49].

Работ по другим направлениям исследований, несвязанных с инфекционным процессом и объединенных одной темой, крайне мало. В 2020 г. китайскими учеными проведено секвенирование РНК единичных клеток (scRNA-seq) с целью обнаружить новые гены-маркеры внутримышечных адипоцитов. Кластеризация единичных клеток по транскриптомам показала наличие обособленного кластера с высоким уровнем экспрессии гена ADIPOQ, на основании чего был сделан вывод о том, что это кластер ADIPOQ+-адипоцитов. В результате анализа исследователями обнаружены два новых гена-кандидата внутримышечных жировых клеток: APOA1 и COL1A1. Для валидации маркеров использовали RNAscope, и таким образом была доказана специфичность двух новых биомаркеров для дальнейших исследований гетерогенной структуры мышц кур [50].

Методы гибридизации РНК in situ позволяют не только определять специфичный для конкретных популяций клеток профиль экспрессируемых генов, но и изучать сложные транскриптомные взаимодействия. Так, в 2019 г. китайскими исследователями доказано, что обнаруженная ими ранее lncRNA (длинная некодирующая РНК) IMFNCR является “губкой” для miR-128-3p и miR-27b-3p (miR – микроРНК), которые, в свою очередь, являются ингибиторами экспрессии PPARG (PPARG – гамма-рецептор, активируемый пролифератором пероксисом, ключевой фактор транскрипции для регуляции липидного обмена и дифференциации преадипоцитов). Таким образом, c помощью набора детекции РНК in situ RiboBio (Guangzhou RiboBio Co., Китай) сделан вывод о том, что уровень экспрессии lncRNA IMFNCR это маркер дифференциации преадипоцитов во внутримышечной жировой ткани [51], количество которой является показателем качества куриного мяса [52].

В производстве куриного мяса качество получаемой продукции является определяющий фактор эффективности производства. Например, существует такая проблема как синдром “деревянной грудки” – дефект качества мяса, наносящий экономический ущерб птицеводству [53, 54]. В 2019 г. была исследована взаимосвязь между изменениями в метаболизме липидов, появлением медленных изоформ миофибрилл в мышцах Pectoralis major у коммерческих цыплят-бройлеров с развитием “деревянной грудки”. С помощью гибридизации РНК in situ установлена повышенная экспрессия гена липопротеинлипазы в венозном русле пораженных цыплят. Повышенный уровень экспрессии данного фермента, в свою очередь, способствует повышенной проницаемости венозного эндотелия для свободных жирных кислот и остатков липопротеинов, что приводит к развитию очага лимфоцитарного флебита. Авторами тем же методом исследованы потенциальные гены-маркеры развития “деревянной грудки”, демонстрирующие повышенную экспрессию: MYBPC1, кодирующий миозин-связывающий белок C, участвующий в поддержании структуры саркомера, и CSRP3, белок которого играет роль в передаче механосенсорных сигналов. Однако более подробные исследования ассоциированных с этими маркерами процессов еще предстоят [55].

Проводимые исследования с использованием кур в качестве модельных объектов не ограничиваются работами по продуктивности [56, 57]. В 2016 г. европейскими учеными изучена зависимость пролиферации и дифференциации клеток головного мозга от экспрессии генов регуляторов обмена тиреоидных гормонов в развивающемся мозжечке эмбрионов кур [58]. В ряде работ показаны клеточные и тканевые паттерны экспрессии транспортеров и дейодиназ тиреоидных гормонов в мозжечке эмбрионов, а также общая картина зависимости развития от них у нескольких типов клеток (в том числе клеток Пуркинье) уже в раннем эмбриогенезе [58–60]. Изучены особенности развития ренин-ангиотензиновой системы во время эмбриогенеза и раннего постнатального онтогенеза цыплят. Показано, что ренин экспрессируется в ренальных и экстраренальных структурах, но с возрастом (30 дней после вылупления) обнаруживается только в юкстагломерулярных клеточных областях почек [26]. Эмбрионы кур являются удобным материалом для изучения процессов роста и развития разных тканей и органов, и протоколы для проведения более высокопроизводительных исследований продолжают разрабатываться. Так, была показана адаптация методики повышения оптической прозрачности тотальных препаратов эмбрионов кур с использованием мультиплексной иммуногистохомии и гибридизации РНК in situ [61].

К сожалению, на сегодняшний день проведено мало работ по изучению пространственных транскриптомных особенностей других сельскохозяйственных животных.

Особенности транскриптомики отдельных клеток кишечника представляют интерес не только на курах в качестве модельного объекта. Проведенный в 2022 г. транскриптомный анализ с высоким разрешением показал транскрипционную изолированность для иммунных и эпителиальных клеток тонкого кишечника человека и свиньи [62]. Это первое исследование с помощью scRNA-seq, в котором выявлены транскрипционные различия между интраэпителиальными и субэпителиальными лимфоцитами у свиней. С использованием секвенирования транскриптома единичных клеток таких различий обнаружено не было, поскольку необходимо изолирование лимфоцитов разных слоев кожи [63]. Исследования по транскрипционным различиям интраэпителиальных и субэпителиальных лимфоцитов у свиней in situ с помощью методов гибридизации РНК до сих пор не проведены.

В 2018 г. корейские ученые исследовали экспрессию генов, отвечающих за различные биологические процессы, специфичные для эндометрия, яичников и яйцеводов свиней. Были проведены секвенирование транскриптома и валидация результатов с помощью ОТ-ПЦР с последующей гибридизацией РНК in situ для потенциальных биомаркеров тканеспецифичных процессов. В качестве таких маркеров были идентифицированы следующие гены: CYP7A1, CYP17A1 и CYP19A1, обеспечивающие биосинтез стероидов и локализующиеся в тканях яичников; PTGS2 и PTGER2 – ассоциированы с метаболизмом эйкозаноидов, специфичных для тканей эндометрия. Отмечен высокий уровень экспрессии мРНК CYP7A1 и CYP19A1 в фолликулах яичников в клетках гранулезы, в то время как мРНК CYP17A экспрессируется в основном в тека-клетках яичников. Экспрессия данных маркеров указывает на то, что стероидогенная активность в яичниках опосредована действием тека-клеток и клеток гранулезы. Уровни экспрессии мРНК CYP17A1 и CYP19A1 во время фазы проэструса были высокими. Экспрессия генов PTGS2 и PTGER2 в эндометрии обнаружена в эпителиальных и стромальных клетках с выраженной интенсивностью сигнала в фазе позднего диэструса и проэструса. Можно предположить, что действие простагландинов на эндометрий может иметь решающее значение для функции эндометрия и эстральной цикличности. Авторы считают, что дальнейшие исследования должны быть направлены на выяснение молекулярных функций данных генов для их дальнейшего использования в качестве молекулярных маркеров клеток и тканей [64].

Комплекс методов, включающий гибридизацию РНК in situ, иммуногистохимию и радиоиммуноанализ, использован для изучения связи функций нейроэндокринной системы и фертильности молочных коров. Исследован уровень экспрессии мРНК гипоталамического нейропептида Kiss1, который стимулирует секрецию гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ) и опосредует эффекты обратной связи половых стероидов на секрецию ГнРГ в дугообразном ядре гипоталамуса. Установлено, что снижение экспрессии Kiss1 может являться фактором снижения фертильности коров [65].

B.T. Mohammed и F.X. Donadeu с помощью гибридизации РНК in situ изучили экспрессию miR-202 в клетках Сертоли и гоноцитах в семенниках быков. Результаты исследования показали изменения в экспрессии miR-202 на разных стадиях развития гоноцитов во время сперматогенеза. Уровень экспрессии miR-202 был выше в сперматогониях и первичных сперматоцитах, расположенных вблизи базального отдела семенных канальцев, по сравнению со вторичными сперматоцитами и сперматидами. Используя доступные базы данных о микроРНК, для miR-202 идентифицировано в общей сложности 466 предполагаемых генов-мишеней (в том числе мишень рапамицина – mTOR), что дает основания предполагать ключевую роль miR-202 в регуляции созревания и жизнеспособности гоноцитов в семенниках быков [66], а также ее роль в регуляции первого деления зиготы [67].

В 2020 г. китайскими учеными проведено комплексное исследование роли lncRNA LncIMF4 во внутримышечном адипогенезе у преадипоцитов с использованием секвенирования транскриптома и гибридизации РНК in situ. Авторы утверждают, что нокдаун LncIMF4 малой интерферирующей РНК стимулирует пролиферацию и дифференцировку внутримышечных адипоцитов свиней, поскольку происходит ослабление процессов аутофагии внутриклеточных липидов [68]. Сравнительные исследования энтеральной нервной системы человека и подсвинков с помощью секвенирования транскриптома позволили идентифицировать среди картированных клеток три основные нейрональные (холин-, NO- и глутаматергические) и две глиальные субпопуляции, их дискриминационные маркерные гены были валидизированы с помощью RNAscope [69].

В доступных источниках литературы не найдено комплексных работ с использованием методов гибридизации РНК in situ, посвященных изучению видовых транскриптомных различий сельскохозяйственных животных и птицы. Существуют работы, в которых изучены процессы, подробно описанные у других животных (например, крыс и мышей), а также атласы, посвященные изучению паттернов экспрессии эмбрионов мышей [70], все те же аспекты еще предстоит исследовать у продуктивных животных. Например, лептин и фактор некроза опухолей являются взаимосвязанными адипокинами, однако на основании полученных результатов по FISH-TSA картированию генов, ИГХ и ОТ-ПЦР в 2019 г. сделано предположение, что роль в качестве адипокина для фактора некроза опухолей может быть свойственна только млекопитающим [23]. Впервые в 2017 г. для кур были подробно изучены особенности экспрессии панкреатических полипептидов в зависимости от режима и рациона питания [71]. На сегодняшний день не существует исследований с использованием, например, одной группы генов в разрезе их пространственных особенностей расположения и клеточной принадлежности для разных видов животных. Известно только одно исследование различий в регуляции и организации внеклеточного матрикса (гиалуроновая кислота и коллаген) яичников крупного рогатого скота и свиней. Однако при проведении оценки уровня экспрессии генов, участвующих в синтезе коллагена (Col3a1, Col1a1), генов гиалуронидаз (Hyal1, Hyal2, Tmem2 и Kiaa1199) и синтаз гиалуронана (Has1, Has2, Has3), как утверждают сами авторы, экспериментальная выборка была слишком мала, чтобы сделать окончательные выводы об их свойствах, а РНК FISH для одной из гиалуронидаз был проведен только на мышах [72]. Только в 2019 г. изучены особенности пространственной экспрессии гена лептина и его рецепторов в коже крупного рогатого скота. Показано, что адипоциты отсутствуют около волосяных фолликулов [73]. Напротив, в исследовании кожи собак обнаружена экспрессия молекул лептина около волосяных фолликулов, а также рецепторов лептина на клетках сальных желез [74], что свидетельствует о морфологических различиях в структуре волосистой части кожи разных видов. Уже известно, что у человека белая жировая ткань кожи играет паракринную роль в росте и развитии волосяных фолликулов, однако некоторые механизмы путей этого сигналинга не изучены. Например, как адипокины влияют на секретируемый кожной белой жировой тканью фактор роста гепатоцитов, который, в конечном счете, оказывает влияние на рост волосяных фолликулов [75]. Учитывая транскриптомные различия в структуре тканей кожи разных видов, имеются основания предполагать отсутствие паракринного контроля адипозной тканью развития волосяных фолликулов у крупного рогатого скота.

Одним из перспективных направлений использования гибридизации РНК in situ является изучение пространственной экспрессии генов для понимания процессов структурно-функциональной дегенерации тканей [76], испытывающих нагрузку при метаболических дисбалансах, связанных с промышленным содержанием продуктивных животных. В данной области использование методов пространственной транскриптомики и метаболомики еще предстоит для ряда маркеров и процессов (инсулин-инсулиноподобный сигналинг, мишень рапамицина, сигнальные пути MAPK, сиртуины, рецепторы PPAR, бета-галактозидаза и другие) [77–80]. Такие исследования позволят по-новому взглянуть на физиологические и патологические процессы метаболического старения тканей.

Еще одним методом исследования пространственной экспрессии генов является секвенирование РНК in situ [81–83]. В сельскохозяйственной биологии количество таких работ крайне мало. Группой исследователей из КНР проведено транскриптомное исследование мышечной и жировой ткани свиней. Использованы секвенирование транскриптома единичных клеток и анализ пространственной экспрессии с помощью Visium (10× Genomics Inc, США). Определены особенности миофибрилльного состава мышц. В результате работы охарактеризована транскриптомная изменчивость и идентифицированы молекулярные механизмы, лежащие в основе экономически ценных признаков у свиней. Помимо новых, ранее неизученных транскриптов (в том числе транскриптов с неопределенным кодирующим потенциалом, микроРНК, кольцевых РНК, длинных некодирующих РНК), исследователями обнаружено, что более глубокие слои скелетной мышечной ткани (участвуют в поддержании положения тела), характеризующиеся быстрым окислительным метаболизмом, имели больше мРНК миофибрилл I типа по сравнению с поверхностными слоями (участвуют в быстрых движениях), которые содержат больше мРНК миофибрилл IIB типа [84]. В другом исследовании с помощью секвенирования транскриптома in situ (Visium, 10× Genomics Inc.), секвенирования единичных клеток и валидации генов-маркеров цепной реакцией гибридизации v3.0 [24] изучен эмбриогенез сердечной мышцы цыплят на нескольких сроках развития. Результаты комплексного подхода в секвенировании клеток были валидированы с помощью ИГХ и гибридизации РНК in situ, что позволило исследователям предположить участие клеток эпикардиального происхождения в регуляции экспрессии ключевых генов белков внеклеточного матрикса, вовлеченных в миграции клеток [85].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время представлено ограниченное количество работ по исследованию экспрессии генов in situ не только в Российской Федерации, но и за рубежом. В отечественной ветеринарной медицине подобных работ не проводилось. В связи с этим большой объем фундаментальных знаний, полученный секвенированием транскриптома, остается невоспроизведенным с помощью гистологических методик. Такое последовательное комплексное воспроизведение результатов секвенирования реализуется, но недостаточно распространено.

К сожалению, на сегодняшний день проведено мало исследований по изучению пространственных транскриптомных особенностей сельскохозяйственных животных. Несмотря на разнообразие доступных технологий и их постоянное совершенствование, у свиней и крупного рогатого скота более детальные исследования экспрессии генов еще предстоят.

Также актуальным является изучение течения инфекционного процесса с точки зрения экспрессии генов противо- и провоспалительных маркеров в различных тканях.

Таким образом, представляется перспективной разработка отечественной технологии для оценки уровня экспрессии in situ с использованием гибридизационных зондов по технологии, принцип работы которой находился бы в открытом доступе. На сегодняшний день подобные разработки с использованием новых доступных химических компонентов в России отсутствуют, как и коммерческие наборы для проведения данного анализа.

Работа выполнена в рамках Государственного задания Минобрнауки России по теме № 0532-2022-0004 “Разработка технологии для маркер-ориентированной селекции крупного рогатого скота по генам, ассоциированным с устойчивостью к заболеваниям”.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

×

Об авторах

М. В. Бытов

Уральский федеральный аграрный научно-исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: nauka_sokolova@mail.ru
Россия, Екатеринбург

В. Д. Зубарева

Уральский федеральный аграрный научно-исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук

Email: nauka_sokolova@mail.ru
Россия, Екатеринбург

С. В. Вольская

Уральский федеральный аграрный научно-исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук

Email: nauka_sokolova@mail.ru
Россия, Екатеринбург

С. Л. Хацко

Уральский федеральный аграрный научно-исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук; Уральский федеральный университет им. первого Президента России Б. Н. Ельцина

Email: nauka_sokolova@mail.ru
Россия, Екатеринбург; Екатеринбург

И. А. Шкуратова

Уральский федеральный аграрный научно-исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук

Email: nauka_sokolova@mail.ru
Россия, Екатеринбург

О. В. Соколова

Уральский федеральный аграрный научно-исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук

Email: nauka_sokolova@mail.ru
Россия, Екатеринбург

Список литературы

  1. Riollet C., Rainard P., Poutrel B. Cell subpopulations and cytokine expression in cow milk in response to chronic Staphylococcus aureus infection // J. Dairy. Sci. 2001. V. 84. № 5. P. 1077–1084. https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(01)74568-7
  2. Kong R.S., Liang G., Chen Y. et al. Transcriptome profiling of the rumen epithelium of beef cattle differing in residual feed intake // BMC Genomics. 2016. V. 17. Article ID 592. https://doi.org/10.1186/s12864-016-2935-4
  3. Resnyk C.W., Chen C., Huang H. et al. RNA-Seq analysis of abdominal fat in genetically fat and lean chickens highlights a divergence in expression of genes controlling adiposity, hemostasis, and lipid metabolism // PLoS One. 2015. V. 10. № 10. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0139549
  4. Li X., Wang C.Y. From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing // Int. J. Oral. Sci. 2021. V. 13. № 1. Article ID 36. https://doi.org/10.1038/s41368-021-00146-0
  5. Jovic D., Liang X., Zeng H. et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview // Clin. Transl. Med. 2022. V. 12. № 3. Article ID e694. https://doi.org/10.1002/ctm2.694
  6. Hwang B., Lee J.H., Bang D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines // Exp. Mol. Med. 2018. V. 50. № 8. P. 1–14. https://doi.org/10.1038/s12276-018-0071-8
  7. Wiarda J.E., Trachsel J.M., Sivasankaran S.K. et al. Intestinal single-cell atlas reveals novel lymphocytes in pigs with similarities to human cells // Life Sci. Alliance. 2022. V. 5. № 10. https://doi.org/10.26508/lsa.202201442
  8. Junhong W., Mingyang C., Ming G. et al. Single-cell transcriptional analysis of lamina propria lymphocytes in the jejunum reveals ILC-like cells in pigs // bioRxiv. 2023. https://doi.org/10.1101/2023.01.01.522424
  9. Eng C.L., Lawson M., Zhu Q. et al. Transcriptome-scale super-resolved imaging in tissues by RNA seqFISH // Nature. 2019. V. 568. № 7751. P. 235–239. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1049-y
  10. Cassidy A., Jones J. Developments in situ hybridisation // Methods. 2014. V. 70. № 1. P. 39–45. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2014.04.006
  11. Young A.P., Jackson D.J., Wyeth R.C. A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization // PeerJ. 2020. V. 8. https://doi.org/10.7717/peerj.8806
  12. Weise A., Liehr T. Rapid prenatal aneuploidy screening by fluorescence in situ hybridization (FISH) // Methods Mol. Biol. 2019. V. 1885. P. 129–137. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-8889-1_9
  13. Prudent E., Raoult D. Fluorescence in situ hybridization, a complementary molecular tool for the clinical diagnosis of infectious diseases by intracellular and fastidious bacteria // FEMS Microbiol. Rev. 2019. V. 43. № 1. P. 88–107. https://doi.org/10.1093/femsre/fuy040
  14. O’Connor S.J.M., Turner K.R., Barrans S.L. Practical application of fluorescent in situ hybridization techniques in clinical diagnostic laboratories // Methods Mol. Biol. 2020. V. 2148. P. 35–70. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-0623-0_3
  15. Chrzanowska N.M., Kowalewski J., Lewandowska M.A. Use of fluorescence in situ hybridization (FISH) in diagnosis and tailored therapies in solid tumors // Molecules. 2020. V. 25. № 8. https://doi.org/10.3390/molecules25081864
  16. Zirkel A., Papantonis A. Detecting circular RNAs by RNA fluorescence in situ hybridization // Methods Mol. Biol. 2018. V. 1724. P. 69–75. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-7562-4_6
  17. Uhl G.R. In situ hybridization: quantitation using radiolabeled hybridization probes // Methods Enzymol. 1989. V. 168. P. 741–752. https://doi.org/10.1016/0076-6879(89)68055-x
  18. Wang F., Flanagan J., Su N. et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues // J. Mol. Diagn. 2012. V. 14. № 1. P. 22–29. https://doi.org/10.1016/j.jmoldx.2011.08.002
  19. Itzkovitz S., van Oudenaarden A. Validating transcripts with probes and imaging technology // Nat. Methods. 2011. V. 8. № 4. P. S12–S19. https://doi.org/10.1038/nmeth.1573
  20. Kang H., Sheng L., Yongsheng C. HuluFISH non-denaturing in situ detection of genomic DNA opened by CRISPR-Cas9 Nickase and Exonuclease // bioRxiv. 2021. https://doi.org/10.1101/2021.12.23.473974
  21. Asp M., Bergenstråhle J., Lundeberg J. Spatially resolved transcriptomes – next generation tools for tissue exploration // BioEssays. 2020. V. 42. № 10. https://doi.org/10.1002/bies.201900221
  22. Speel E.J., Hopman A.H., Komminoth P. Tyramide signal amplification for DNA and mRNA in situ hybridization // Methods Mol. Biol. 2006. V. 326. P. 33–60. https://doi.org/10.1385/1-59745-007-3:33
  23. Seroussi E., Knytl M., Pitel F. et al. Avian expression patterns and genomic mapping implicate leptin in digestion and TNF in immunity, suggesting that their interacting adipokine role has been acquired only in mammals // Intern. J. Mol. Sciences. 2019. V. 20. № 18. https://doi.org/10.3390/ijms20184489
  24. Choi H.M.T., Schwarzkopf M., Fornace M.E. et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust // Development. 2018. V. 145. № 12. https://doi.org/10.1242/dev.165753
  25. Jeong W., Bae H., Lim W. et al. Dicer1, AGO3, and AGO4 microRNA machinery genes are differentially expressed in developing female reproductive organs and overexpressed in cancerous ovaries of chickens // J. Animal Science. 2017. V. 95. № 11. P. 4857–4868. https://doi.org/10.2527/jas2017.1846
  26. Hoy J., Nishimura H., Mehalic T. et al. Ontogeny of renin gene expression in the chicken, Gallus gallus // General and Comparative Endocrinology. 2020. V. 296. https://doi.org/10.1016/j.ygcen.2020.113533
  27. Ogata M., Hayashi G., Ichiu A. et al. l-DNA-tagged fluorescence in situ hybridization for highly sensitive imaging of RNAs in single cells // Organic & Biomol. Chemistry. 2020. V. 18. № 40. P. 8084–8088. https://doi.org/10.1039/d0ob01635g
  28. Veselinyová D., Mašlanková J., Kalinová K. et al. Selected in situ hybridization methods: principles and application // Molecules. 2021. V. 26. № 13. https://doi.org/10.3390/molecules26133874
  29. Schwarzkopf M., Choi H.M.T., Pierce N.A. Multiplexed quantitative in situ hybridization for mammalian cells on a slide: qHCR and dHCR imaging (v3.0) // Methods Mol. Biol. 2020. V. 2148. P. 143–156. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-0623-0_9
  30. Tsuneoka Y., Funato H. Modified in situ hybridization chain reaction using short hairpin DNAs // Frontiers Mol. Neurosci. 2020. V. 13. https://doi.org/10.3389/fnmol.2020.00075
  31. Baena-Del Valle J.A., Zheng Q., Hicks J.L. et al. Rapid loss of RNA detection by in situ hybridization in stored tissue blocks and preservation by cold storage of unstained slides // Am. J. Clin. Pathology. 2017. V. 148. № 5. P. 398–415. https://doi.org/10.1093/ajcp/aqx094
  32. Xiao L., Labaer J., Guo J. Highly sensitive and multiplexed in situ RNA profiling with cleavable fluorescent tyramide // Cells. 2021. V. 10. № 6. https://doi.org/10.3390/cells10061277
  33. Alon S., Goodwin D.R., Sinha A. et al. Expansion sequencing: Spatially precise in situ transcriptomics in intact biological systems // Science. 2021. V. 371. № 6528. https://doi.org/10.1126/science.aax2656
  34. Lee J.H., Daugharthy E.R., Scheiman J. et al. Fluorescent in situ sequencing (FISSEQ) of RNA for gene expression profiling in intact cells and tissues // Nat. Protocols. 2015. V. 10. № 3. P. 442–458. https://doi.org/10.1038/nprot.2014.191
  35. Payne A.C., Chiang Z.D., Reginato P.L. et al. In situ genome sequencing resolves DNA sequence and structure in intact biological samples // Science. 2021. V. 371. № 6532. https://doi.org/10.1126/science.aay3446
  36. Kishi J.Y., Liu N., West E.R. et al. Light-Seq: Light-directed in situ barcoding of biomolecules in fixed cells and tissues for spatially indexed sequencing // Nat. Methods. 2022. V. 19. № 11. P. 1393–1402. https://doi.org/10.1038/s41592-022-01604-1
  37. Pandit K., Petrescu J., Cuevas M. et al. An open source toolkit for repurposing Illumina sequencing systems as versatile fluidics and imaging platforms // Scientific Reports. 2022. V. 12. № 1. Article ID 5081. https://doi.org/10.1038/s41598-022-08740-w
  38. Williams C.G., Lee H.J., Asatsuma T. et al. An introduction to spatial transcriptomics for biomedical research // Genome Medicine. 2022. V. 14. № 1. Article ID 68. https://doi.org/10.1186/s13073-022-01075-1
  39. Sicherre E., Favier A.L., Riccobono D., Nikovics K. Non-specific binding, a limitation of the immunofluorescence method to study macrophages in situ // Genes. 2021. V. 12. № 5. https://doi.org/10.3390/genes12050649
  40. Skaugen J.M., Seethala R.R., Chiosea S.I. et al. Evaluation of NR4A3 immunohistochemistry (IHC) and fluorescence in situ hybridization and comparison with DOG1 IHC for FNA diagnosis of acinic cell carcinoma // Cancer Cytopathology. 2021. V. 129. № 2. P. 104–113. https://doi.org/10.1002/cncy.22338
  41. Atout S., Shurrab S., Loveridge C. Evaluation of the suitability of RNAscope as a technique to measure gene expression in clinical diagnostics: a systematic review // Mol. Diagn. Ther. 2022. V. 26. № 1. P. 19–37. https://doi.org/10.1007/s40291-021-00570-2
  42. Liu K., Jia M., Wong E.A. Delayed access to feed affects broiler small intestinal morphology and goblet cell ontogeny // Poult. Sci. 2020. V. 99. № 11. P. 5275–5285. https://doi.org/10.1016/j.psj.2020.07.040
  43. Reynolds K.L., Cloft S.E., Wong E.A. Changes with age in density of goblet cells in the small intestine of broiler chicks // Poult. Sci. 2020. V. 99. № 5. P. 2342–2348. https://doi.org/10.1016/j.psj.2019.12.052
  44. Cloft S.E., Uni Z., Wong E.A. Profiling intestinal stem and proliferative cells in the small intestine of broiler chickens via in situ hybridization during the peri-hatch period // Poult. Sci. 2023. V. 102. № 4. https://doi.org/10.1016/j.psj.2023.102495
  45. Fries-Craft K.A., Meyer M.M., Lindblom S.C. et al. Lipid source and peroxidation status alter immune cell recruitment in broiler chicken ileum // J. Nutr. 2021. V. 151. № 1. P. 223–234. https://doi.org/10.1093/jn/nxaa356
  46. Reicher N., Melkman-Zehavi T., Dayan J. et al. It’s all about timing: early feeding promotes intestinal maturation by shifting the ratios of specialized epithelial cells in chicks // Front. Physiol. 2020. V. 11. https://doi.org/10.3389/fphys.2020.596457
  47. Reicher N., Melkman-Zehavi T., Dayan J. et al. Nutritional stimulation by in-ovo feeding modulates cellular proliferation and differentiation in the small intestinal epithelium of chicks // Anim. Nutr. 2022. V. 8. № 1. P. 91–101. https://doi.org/10.1016/j.aninu.2021.06.010
  48. Reicher N., Melkman-Zehavi T., Dayan J. et al. Intra-amniotic administration of l-glutamine promotes intestinal maturation and enteroendocrine stimulation in chick embryos // Sci. Rep. 2022. V. 12. № 1. Article ID 2645. https://doi.org/10.1038/s41598-022-06440-z
  49. Zhang H., Wong E.A. Identification of cells expressing OLFM4 and LGR5 mRNA by in situ hybridization in the yolk sac and small intestine of embryonic and early post-hatch chicks // Poult. Sci. 2018. V. 97. № 2. P. 628–633. https://doi.org/10.3382/ps/pex328
  50. Li J., Xing S., Zhao G. et al. Identification of diverse cell populations in skeletal muscles and biomarkers for intramuscular fat of chicken by single-cell RNA sequencing // BMC Genomics. 2020. V. 21. № 1. Article ID 752. https://doi.org/10.1186/s12864-020-07136-2
  51. Zhang M., Li F., Sun J.W. et al. LncRNA IMFNCR promotes intramuscular adipocyte differentiation by sponging miR-128-3p and miR-27b-3p // Front. Genet. 2019. V. 10. https://doi.org/10.3389/fgene.2019.00042
  52. Luo N., Shu J., Yuan X. et al. Differential regulation of intramuscular fat and abdominal fat deposition in chickens // BMC Genomics. 2022. V. 23. № 1. Article ID 308. https://doi.org/10.1186/s12864-022-08538-0
  53. Liu J., Puolanne E., Schwartzkopf M. et al. Altered sarcomeric structure and function in Woody Breast myopathy of avian pectoralis major muscle // Front. Physiol. 2020. V. 11. https://doi.org/10.3389/fphys.2020.00287
  54. Bordignon F., Xiccato G., Boskovic Cabrol M. et al. Factors affecting breast myopathies in broiler chickens and quality of defective meat: a meta-analysis // Front. Physiol. 2022. V. 13. https://doi.org/10.3389/fphys.2022.933235
  55. Papah M.B., Abasht B. Dysregulation of lipid metabolism and appearance of slow myofiber-specific isoforms accompany the development of Wooden Breast myopathy in modern broiler chickens // Sci. Rep. 2019. V. 9. № 1. https://doi.org/10.1038/s41598-019-53728-8
  56. Darras V.M. Deiodinases: How nonmammalian research helped shape our present view // Endocrinology. 2021. V. 162. № 6. https://doi.org/10.1210/endocr/bqab039
  57. Too H.C., Shibata M., Yayota M. et al. Expression of thyroid hormone regulator genes in the yolk sac membrane of the developing chicken embryo // J. Reprod. Dev. 2017. V. 63. № 5. P. 463–472. https://doi.org/10.1262/jrd.2017-017
  58. Delbaere J., Van Herck S.L., Bourgeois N.M. et al. Mosaic expression of thyroid hormone regulatory genes defines cell type-specific dependency in the developing chicken cerebellum // Cerebellum. 2016. V. 15. № 6. P. 710–725. https://doi.org/10.1007/s12311-015-0744-y
  59. Darras V.M. The role of maternal thyroid hormones in avian embryonic development // Front. Endocrinol. 2019. V. 10. https://doi.org/10.3389/fendo.2019.00066
  60. Delbaere J., Vancamp P., Van Herck S.L. et al. MCT8 deficiency in Purkinje cells disrupts embryonic chicken cerebellar development // J. Endocrinol. 2017. V. 232. № 2. P. 259–272. https://doi.org/10.1530/JOE-16-0323
  61. Morrison J.A., McKinney M.C., Kulesa P.M. Resolving in vivo gene expression during collective cell migration using an integrated RNAscope, immunohistochemistry and tissue clearing method // Mech. Dev. 2017. V. 148. P. 100–106. https://doi.org/10.1016/j.mod.2017.06.004
  62. Wiarda J.E., Loving C.L. Intraepithelial lymphocytes in the pig intestine: T cell and innate lymphoid cell contributions to intestinal barrier immunity // Front. Immunol. 2022. V. 13. https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.1048708
  63. Wiarda J.E., Becker S.R., Sivasankaran S.K. et al. Regional epithelial cell diversity in the small intestine of pigs // J. Anim. Sci. 2023. V. 101. https://doi.org/10.1093/jas/skac318
  64. Kim J.M., Park J.E., Yoo I. et al. Integrated transcriptomes throughout swine oestrous cycle reveal dynamic changes in reproductive tissues interacting networks // Sci. Rep. 2018. V. 8. № 1. https://doi.org/10.1038/s41598-018-23655-1
  65. Clarke I.J., Reed C.B., Burke C.R. et al. Kiss1 expression in the hypothalamic arcuate nucleus is lower in dairy cows of reduced fertilitydagger // Biol. Reprod. 2022. V. 106. № 4. P. 802–813. https://doi.org/10.1093/biolre/ioab240
  66. Mohammed B.T., Donadeu F.X. Localization and in silico-based functional analysis of miR-202 in bull testis // Reprod. Domest. Anim. 2022. V. 57. № 9. P. 1082–1087. https://doi.org/10.1111/rda.14159
  67. Wang M., Du Y., Gao S. et al. Sperm-borne miR-202 targets SEPT7 and regulates first cleavage of bovine embryos via cytoskeletal remodeling // Development. 2021. V. 148. № 5. https://doi.org/10.1242/dev.189670
  68. Sun Y., Cai R., Wang Y. et al. A newly identified LncRNA LncIMF4 controls adipogenesis of porcine intramuscular preadipocyte through attenuating autophagy to inhibit lipolysis // Animals. 2020. V. 10. № 6. https://doi.org/10.3390/ani10060926
  69. Li T., Morselli M., Su T. et al. Comparative transcriptomics reveals highly conserved regional programs between porcine and human colonic enteric nervous system // Commun. Biol. 2023. V. 6. № 1. Article ID 98. https://doi.org/10.1038/s42003-023-04478-x
  70. Visel A., Thaller C., Eichele G. GenePaint.org: An atlas of gene expression patterns in the mouse embryo // Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. P. D552–D556. https://doi.org/10.1093/nar/gkh029
  71. Reid A.M.A., Wilson P.W., Caughey S.D. et al. Pancreatic PYY but not PPY expression is responsive to short-term nutritional state and the pancreas constitutes the major site of PYY mRNA expression in chickens // Gen. Comp. Endocrinol. 2017. V. 252. P. 226–235. https://doi.org/10.1016/j.ygcen.2017.07.002
  72. Parkes W.S., Amargant F., Zhou L.T. et al. Hyaluronan and collagen are prominent extracellular matrix components in bovine and porcine ovaries // Genes. 2021. V. 12. № 8. https://doi.org/10.3390/genes12081186
  73. Mercati F., Dall’Aglio C., Timperi L. et al. Epithelial expression of the hormone leptin by bovine skin // Eur. J. Histochem. 2019. V. 63. № 1. https://doi.org/10.4081/ejh.2019.2993
  74. Brement T., Cossec C., Roux C. et al. Expression of three adipokines (adiponectin, leptin and resistin) in normal canine skin: a pilot study // J. Comp. Pathol. 2019. V. 167. P. 82–90. https://doi.org/10.1016/j.jcpa.2018.10.179
  75. Nicu C., O’Sullivan J.D.B., Ramos R. et al. Dermal adipose tissue secretes hgf to promote human hair growth and pigmentation // J. Invest. Dermatol. 2021. V. 141. № 7. P. 1633–1645. https://doi.org/10.1016/j.jid.2020.12.019
  76. Wasserfall C., Nick H.S., Campbell-Thompson M. et al. Persistence of pancreatic insulin mrna expression and proinsulin protein in type 1 diabetes pancreata // Cell Metab. 2017. V. 26. № 3. P. 568-575. https://doi.org/10.1016/j.cmet.2017.08.013
  77. Amorim J.A., Coppotelli G., Rolo A.P. et al. Mitochondrial and metabolic dysfunction in ageing and age-related diseases // Nat. Rev. Endocrinol. 2022. V. 18. № 4. P. 243–258. https://doi.org/10.1038/s41574-021-00626-7
  78. Sandhu B., Perez Matos M.C., Tran S. et al. Quantitative digital pathology reveals association of cell-specific PNPLA3 transcription with NAFLD disease activity // JHEP Rep. 2019. V. 1. № 3. P. 199–202. https://doi.org/10.1016/j.jhepr.2019.05.007
  79. Kim H.J., Cheng P., Travisano S. et al. Molecular mechanisms of coronary artery disease risk at the PDGFD locus // Nat. Commun. 2023. V. 14. № 1. https://doi.org/10.1038/s41467-023-36518-9
  80. Pedroza A.J., Tashima Y., Shad R. et al. Single-cell transcriptomic profiling of vascular smooth muscle cell phenotype modulation in marfan syndrome aortic aneurysm // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2020. V. 40. № 9. P. 2195–2211. https://doi.org/10.1161/ATVBAHA.120.314670
  81. Choe K., Pak U., Pang Y. et al. Advances and challenges in spatial transcriptomics for developmental biology // Biomolecules. 2023. V. 13. № 1. https://doi.org/10.3390/biom13010156
  82. Zhang L., Chen D., Song D. et al. Clinical and translational values of spatial transcriptomics // Signal Transduct. Target. Ther. 2022. V. 7. № 1. https://doi.org/10.1038/s41392-022-00960-w
  83. Wirth J., Huber N., Yin K. et al. Spatial transcriptomics using multiplexed deterministic barcoding in tissue // Nat. Commun. 2023. V. 14. № 1. https://doi.org/10.1038/s41467-023-37111-w
  84. Jin L., Tang Q., Hu S. et al. A pig BodyMap transcriptome reveals diverse tissue physiologies and evolutionary dynamics of transcription // Nat. Commun. 2021. V. 12. № 1. https://doi.org/10.1038/s41467-021-23560-8
  85. Mantri M., Scuderi G.J., Abedini-Nassab R. et al. Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis // Nat. Commun. 2021. V. 12. № 1. https://doi.org/10.1038/s41467-021-21892-z

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Принцип работы технологии RNAscope, использующей ZZ-зонды.

Скачать (1MB)
Метаданные
3. Рис. 2. Технологии с “открытым” принципом работы: а – тирамид-сигнальная амплификация; б – цепная реакция гибридизации in situ; в – дигоксигенин-меченные зонды и флуоресцентно меченные антитела.

Скачать (1MB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».