Polymorphism of microsatellite loci in populations of Caucasian rock lizards and its use for assessing the genetic diversity of Darevskia raddei

D. O. Odegov; Одегов Д. О.; A. A. Valyaeva; Валяева А. А.; M. S. Arakelyan; Аракелян М. С.; A. P. Ryskov; Рысков А. П.; V. I. Korchagin; Корчагин В. И.; I. A. Martirosyan; Мартиросян И. А.

doi:10.31857/S0016675824030069

Полиморфизм микросателлитных локусов в популяциях кавказских скальных ящериц и его использование для оценки генетического разнообразия комплекса Darevskia raddei

Авторы: Одегов Д.О.¹, Валяева А.А.¹, Аракелян М.С.², Рысков А.П.¹, Корчагин В.И.¹, Мартиросян И.А.¹
Учреждения:
1. Институт биологии гена Российской академии наук
2. Ереванский государственный университет
Выпуск: Том 60, № 3 (2024)
Страницы: 59-67
Раздел: ГЕНЕТИКА ЖИВОТНЫХ
URL: https://journal-vniispk.ru/0016-6758/article/view/262297
DOI: https://doi.org/10.31857/S0016675824030069
EDN: https://elibrary.ru/DPBCHD
ID: 262297

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Изучение кавказских скальных ящериц комплекса Darevskia raddei sensu lato, представленного несколькими подвидами, имеет большой интерес и научную значимость в связи с их участием в межвидовых гибридизациях с образованием пяти из семи известных однополых (партеногенетических) видов рода Darevskia. В статье приведены генетические параметры для популяций (подвидов) D. r. raddei и D. r. nairensis, полученные на основе анализа изменчивости десяти микросателлитных локусов 230 особей из 17 популяций Армении и Арцаха (Нагорного Карабаха). Согласно этим параметрам, популяции D. r. raddei характеризуются большим разнообразием по числу аллелей и генотипов по сравнению с популяциями D. r. nairensis. Анализ генетической дифференциации показал, что популяции D. r. raddei подразделяются на две группы, одна из которых ближе к D .r. nairensis, чем к D. r. raddei. Анализ индекса ассоциаций показал отсутствие свободной перекомбинации аллелей между подвидами, что говорит об их изоляции и отсутствии скрещивания между особями. Таким образом, на основе расширенной популяционной выборки и разработанной панели микросателлитных маркеров получены новые данные о популяционной структуре вида D. raddei, о генетическом разнообразии и дифференциации популяций D. r. raddei и D. r. nairensis.

Ключевые слова

подвид, популяция, ящерицы Darevskia, генетическое разнообразие, популяционная структура, генетическая дифференциация

Полный текст

Кавказские скальные ящерицы Darevskia raddei [1] широко распространены на территории Армянского нагорья и представляют комплекс из четырёх подвидов (Darevskia raddei raddei [2], Darevskia raddei nairensis [3], Darevskia raddei vanensis [4], Darevskia raddei chaldoranensis [5]). Подвиды различаются по морфологии (фолидоз; верхняя сторона тела может иметь разнообразную окраску в коричневых тонах, полоса вдоль спины состоит из множества темных пятен, образуя сетчатый узор; брюшная сторона может быть окрашена в белые, голубые и зеленые тона), высоте обитания над уровнем моря, а также поведенческим паттерном, например способом удержания самцом самки во время спаривания. В настоящее время наиболее изученными являются подвиды D. r. nairensis и D. r. raddei, однако, несмотря на имеющиеся сведения о дивергенции данных подвидов, их таксономическое положение и степень монофилии остаются дискуссионными. Анализ аллельных вариантов ряда аллозимных локусов показал невысокий уровень генетического полиморфизма, а в ходе изучения митохондриальной ДНК было выяснено, что различные популяции D. r. raddei имеют разную степень дивергенции с D. r. nairensis. Вид D. raddei sensu lato является материнским видом для пяти из семи известных партеногенетических представителей рода Darevskia – D. rostombekowi, D. unisexualis, D. sapphirina, D. bendimahiensis и D. uzzelli [6, 7]. Для последних четырех партеновидов отцовским является вид D. valentini [8, 9]. Таким образом, изучение внутривидового разнообразия Darevskia raddei представляет интерес в связи с его участием в межвидовых гибридизациях с образованием однополых дочерних видов, а также с проблемой естественной гибридизации двуполых и дочерних однополых видов скальных ящериц в зоне симпатрии с образованием триплоидных гибридов [10, 11].

Анализ аллельных вариантов 36 аллозимных локусов из шести популяций D. r. nairensis и четырех популяций D. r. raddei также показал невысокий уровень генетического полиморфизма – половина из всех 36 локусов оказались моноаллельными [8]. В нашей предыдущей работе [12] при использовании трех тетрануклеотидных микросателлитных локусов был показан высокий уровень генетической дифференциации этих популяций. В настоящей работе для определения генетических параметров были использованы увеличенные выборки D. r. raddei и D. r. nairensis и новые, более полиморфные, ди- и тринуклеотидные микросателлитные локусы.

Материалы и методы

Сбор материала (фрагменты хвостов) проводили на территории Армении и Арцаха (Нагорного Карабаха) с 1997 г. по 2021 г. Было собрано 225 образцов D. raddei из 17 локалитетов (табл. П1). Образцы из Лчапа, Айраванка и Лчашена были объединены в одну популяцию “Лчашен”, таким образом в работе проанализировано 15 популяций D. raddei.

Работа с животными проводилась в строгом соответствии с правилами Министерства охраны природы Армении (номер разрешения 5/22.1/51043) и этического комитета Московского государственного университета (номер разрешения 24-01). После забора биоматериала ящерицы выпускались в места их обитания. Для сравнения использовали восемь ранее полученных коллекционных образцов ДНК ящериц D. valentini из локалитетов Лчашен, Тэж и Адис (табл. П1). Образцы ДНК были выделены стандартным фенольно-хлороформным методом с использованием протеиназы К.

Поиск микросателлитных локусов в геноме ящерицы D. valentini [13] проводили с использованием конвейера, включающего несколько программ и скриптов на языке Python. На первом этапе с использованием perl-скрипта MISA [14] в геноме был осуществлен поиск микросателлитных повторов с заданной длиной мономера 2 и 3 нуклеотида и с числом повторов не менее 10. Далее с использованием BedTools v2.30.0 [15] и дополнительных скриптов из генома были выбраны все последовательности, удовлетворяющие следующим критериям: 1) размер последовательностей, прилегающих к 5' и 3' концам микросателлита, составляет не менее 100 пн; 2) микросателлит и фланкирующие области не содержат N; 3) фланкирующие области не содержат повторы и последовательности, затрудняющие гибридизацию праймеров. Аналогичный поиск обнаружил ортологичные локусы в черновых геномных сборках D. unisexualis и D. raddei, что позволило использовать данные локусы для анализа внутривидового разнообразия комплекса D. raddei. Для подбора ПЦР-праймеров использовали программу Primer3 [16, 17] при заданной длине искомого продукта, включающего микросателлитый повтор не менее 100 пн, расстоянии от праймеров до микросателлита не менее 10 пн, длине праймеров 20–25 пн и температуре плавления 58–62°С. Наиболее подходящие пары праймеров были проверены на уникальность амплифицируемого продукта локальным поиском in silico в геноме D. valentini с помощью BLAST+ 2.12.0 [18]. Для молекулярно-генетического анализа (генотипирования ДНК) было отобрано 11 микросателлитных локусов (табл. П2).

ПЦР проводили в объеме 20 мкл на 50 нг ДНК с использованием набора “GenPakPCRCore” (Isogene Laboratory) согласно протоколу фирмы-производителя при следующих температурных режимах: денатурация при 94°C − 3 мин, амплификация в течениt 30 циклов (денатурация 94°C – 1 мин, отжиг 60°C – 40 с, элонгация 72°C – 30 с, последний цикл − 5 мин при 72°C). Концентрация каждого праймера составляла 0.2 мкМ. Один из праймеров для амплификации индивидуальных локусов был помечен флуоресцентным красителем по 5' концу. В табл. П2 приведены характеристики локусов и праймеров, использованных в работе. Продукты ПЦР-амплификации фракционировали в 0.8%-ном агарозном геле с последующим выделением фрагментов ДНК с помощью набора GeneJET Gel Extraction Kit (ThermoScientific). Анализ длин амплифицированных фрагментов проводили с помощью капиллярного электрофореза (фрагментный анализ) в компании “Синтол” с использованием генетического анализатора “НАНОФОР-05”. Для определения размеров амплифицированных фрагментов использовали программное обеспечение Peak Scanner v1.0 (Applied Biosystems). Каждый продукт амплификации рассматривался как биаллельный локус: гетерозиготный при наличии двух фрагментов разного размера (два пика при анализе длин амплифицированных фрагментов) и гомозиготный (один пик), если обнаруживался единственный фрагмент.

Результаты генотипирования всех локусов сведены в таблицу и конвертированы с помощью функции df2genind пакета adegenet [19, 20] в объект класса genind для последующего анализа в среде R v4.2.0 [21]. Расчеты частоты нуль-аллелей (т.е. отсутствия ПЦР-продукта вследствие мутаций в последовательностях ДНК, фланкирующих микросателлит, на которые гибридизуются праймеры, что приводит к появлению ложных гомозигот) проводились в программе Rstudio с помощью пакета PopGenReport. Оценку частот аллелей, анализ аллельного и генетического разнообразия проводили с помощью пакетов hierfstat [22], pegas [23] и poppr [24]. Степень генетической дифференциации между D. r. raddei и D. r. nairensis определяли, рассчитывая показатель F_ST [25] и модифицированный вариант G_ST Хедрика [26, 27], учитывающий тенденцию стандартного критерия G_ST недооценивать степень дифференциации между небольшим числом популяций.

Чтобы определить популяционно-генетическую структуру вида D. raddei на основании данных микросателлитного анализа был использован дискриминантный анализ главных компонент (DAPC) [28], реализованный в пакете adegenet [19, 20]. В качестве внешней группы была добавлена выборка D. valentini, при этом анализ проводили без учета имеющихся сведений о популяционной структуре вида. Оптимальное количество генетических кластеров в популяциях определяли с помощью алгоритма k средних (k-means), использующего байесовский информационный критерий. Далее рассчитывалась вероятность отношения конкретных особей к генетическим кластерам.

Индекс ассоциации, использующийся для оценки мультилокусного неравновесия по сцеплению, определяли с использованием пакета poppr [24, 29].

Результаты

Характеристика микросателлитных локусов

На выборке D. raddei для шести тринуклеотидных и пяти динуклеотидных локусов были получены генетические характеристики, такие как число аллелей и генотипов, наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность, а также выравненность (степень равномерности распределения генотипов) и индекс Симпсона (табл. 1). В качестве внешней группы была использована небольшая выборка особей вида D. valentini. Было обнаружено, что наименьшим числом аллелей и генотипов характеризуется локус sc12962, а также для этого локуса характерно наибольшее отклонение наблюдаемой гетерозиготности от ожидаемой. Это связано с неравномерным распределением аллелей в популяциях (рис. 1) и значительным количеством гомозигот по аллелям “119” и “128” (названия аллелей соответствуют размерам в парах нуклеотидов, полученных при анализе длин амплифицированных фрагментов – фрагментом анализе). Отклонения значений наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности были выявлены по всем проанализированным локусам, в связи с этим мы предположили наличие нуль-аллелей по каждому локусу (рис. 2). Как видно из рис. 2, наиболее вероятно присутствие подобных аллелей в случае локуса sc12962. Так как изучаемые локусы характеризуются высоким уровнем полиморфизма и поскольку данные виды относятся к одному роду кавказских скальных ящериц, была проведена оценка совпадающих аллельных вариантов у проанализированных особей D. raddei (оба подвида) и D. valentini (табл. П3). Согласно полученным результатам, наибольшее число совпадающих аллелей между разными видами было выявлено по локусу sc12962. На основании полученных данных мы исключили локус sc12962 из дальнейшего анализа, и таким образом оценка внутривидового разнообразия D. raddei проводилась на основании полиморфизма десяти микросателлитных локусов.

Таблица 1. Генетические характеристики микросателлитных локусов на выборках D. raddei и D. valentini (238 особей)

Локус	Число аллелей	Число генотипов	*1 – D*	H_exp	H_obs	Evenness
sc12962	13	28	0.82	0.74	0.26	0.53
sc4525	52	134	0.99	0.96	0.79	0.81
sc1422	33	90	0.98	0.94	0.76	0.79
sc138	27	65	0.96	0.91	0.69	0.68
sc149	41	107	0.98	0.94	0.86	0.76
sc12560	51	139	0.99	0.96	0.82	0.76
sc7287	35	85	0.98	0.93	0.67	0.73
sc1872	73	148	0.99	0.97	0.71	0.86
sc4045	25	56	0.94	0.86	0.71	0.59
sc10877	56	128	0.98	0.95	0.68	0.67
sc6476	53	145	0.99	0.96	0.85	0.80
Среднее	42	102	0.96	092	0.70	0.73

Примечание. 1 – D – индекс Симпсона (Simpson inde.x); H_exp – ожидаемая гетерозиготность (Nei’s, 1978); H_obs – наблюдаемая гетерозиготность; Evenness – выравненность.

Рис. 1. Число гомозиготных особей по микросателлитному локусу sc12962 на выборках D. raddei и D. valentini.

Рис. 2. Частота нуль-аллелей по каждому локусу на выборках D. raddei и D. valentine.

В табл. П4 приведены генетические параметры (ожидаемая и наблюдаемая гетерозиготность по Нею, выравненность (evenness) и индекс разнообразия Симпсона (1 – D)), полученные на основании полиморфизма десяти микросателлитных локусов и характеризующие внутривидовое разнообразие D. raddei. Они различаются для D. r. raddei и D. r. nairensis: D. r. raddei характеризуется большим числом аллелей и генотипов по сравнению с D. r. nairensis, при этом среднее значение выравненности отличается незначительно. Наиболее полиморфным является локус sc1872 – 71 аллель комбинируется в 142 генотипа. Однако значение наблюдаемой гетерозиготности по этому локусу было ниже, чем для большинства локусов. Наименее полиморфным является локус sc138: 27 аллелей образуют 65 генотипов, при этом величина наблюдаемой гетерозиготности составляет 0.72.

Генетические параметры популяций D. raddei

Популяции D. raddei sensu lato характеризуются различным количеством аллелей и выявленных генотипов, однако полиморфизм для каждого локуса случаен для каждой популяции. Наибольшее число аллелей и генотипов выявлено в популяции “Ереван” (табл. П5), в то время как значение параметра выравненности генотипов в этой популяции самое низкое. Наименьшее значение наблюдаемой гетерозиготности выявлено в популяции Горис, а наибольшее – в популяции Гандзасар и соответственно наиболее близкое к значению ожидаемой гетерозиготности. Частоты аллелей и генотипов для каждой популяции послужили основой для подсчета генотипического разнообразия и генетических дистанций.

Графическое выражение внутривидовой дифференциации и популяционной структуры комплекса Darevskia raddei sensu lato на основе генетических дистанций по Нею, рассчитанных по данным полиморфизма микросателлитных локусов, представлено на рис. 3. Все популяции разделились на три группы: в одну входят популяции D. r. raddei Гегард, Горис, Егегнадзор, Каджаран и Селимский перевал (группа D. r. raddei GG); в другую – популяции D. r. raddei Зуар, Гандзасар, Тартар, Татев и Нрнадзор (группа D. r. raddei TT); в отдельную группу входят все популяции D. r. nairensis и популяция D. r. raddei Гош.

Рис. 3. Неукорененное филогенетическое дерево популяций D. raddei, построенное на основании генетических расстояний по Нею с бутстреп-поддержкой в 100 итераций.

Внутривидовую дифференциацию D. raddei оценивали с помощью параметра G_ST, полученного при попарном сравнении популяций. Значения данного параметра представлены в виде тепловой карты на рис. П1. Все популяции разделяются на те же популяционные группы, как и при использовании генетических дистанций по Нею. Значения G_ST, полученные при попарном сравнении популяции D. r. raddei Гош и популяций D. r. nairensis, варьируют в пределах от 0.31 до 0.6, а при сравнении с популяциями D. r. raddei – в пределах от 0.62 до 0.93 (рис. П1). Таким образом, в дальнейшей работе мы объединили популяцию Гош с популяциями D. r. nairensis.

В табл. 2 приведены результаты оценки внутривидовой дифференциации D. raddei с помощью параметра G_ST с разбиением на три группы, описанные выше. Согласно проведенной оценке группы D. r. raddei ТТ и D. r. nairensis генетически ближе друг другу, нежели группы D. r. raddei TT и D. r. raddei GG – в первом случае значение индекса G_STсоставляет величину 0.44, во втором случае – величину 0.81. Значение параметра G_ST при сравнении групп D. r. raddei GG и D. r. nairensis составляет 0.65. Это может свидетельствовать о более значительной дифференциации этих групп популяций.

Таблица 2. Внутривидовая дифференциация D. raddei на основании генетических дистанций G_ST

Попарные сравнения	G_ST
D. r. raddei–D. r. nairensis	0.36
D. r. raddei TT–D. r.nairensis	0.44
D. r. raddei GG–D. r.nairensis	0.65
D. r. raddei GG–D. r. raddei TT	0.81

Оценку свободной перекомбинации аллелей в пределах подвидов D. raddei проводили с помощью стандартизированного индекса ассоциаций ( $r_{d}$ ). Значение ( $r_{d}$ ) равное 0.13 (p = 0.018) для вида D. raddei в целом (т.е. для обоих подвидов) указывает на незначительную вероятность перекомбинации аллелей между подвидами (рис. 4,а), т.е. данные подвиды изолированы и скрещивание между их особями отсутствует. Значение индекса ассоциации для подвида D. r. raddei (рис. 4,б) составляет 0.145 (p = 0.008), а для подвида D. r. nairensis – 0.106 (p = 0.001) (рис. 4,в), что может свидетельствовать о значительной обособленности популяций в пределах каждого подвида. Анализ значений индекса ассоциаций в пределах групп D. r. raddei GG и D. r. raddei TT (рис. 5,а и 5,б соответственно) показал высокую вероятность свободного скрещивания между особями популяций внутри каждой группы.

Рис. 4. Индекс ассоциации ( $r_{d}$ ) подвидов D. raddei. а – без разделения на подвиды; б – D. r. raddei; в – D. r. nairensis.

Рис. 5. Индекс ассоциации ( $r_{d}$ ) групп популяций D. r. raddei GG (а) и D. r. raddei ТТ (б).

Использование метода дискриминантного анализа главных компонент (DAPC) на всей выборке вида D. raddei и внешней группе D. valentini позволило определить наличие трех генетических кластеров (K = 3), соответствующих виду D. valentini (красный цвет) и подвидам D. r. raddei (желтый цвет) и D. r. nairensis (синий цвет) (рис. 6,а). При разделении подвида D. r. raddei на две группы GG и TT и соответственно увеличении числа кластеров (К = 4) популяции вида D. raddei образуют три незначительно перекрывающиеся облака, соответствующих группам популяций D. r. raddei GG, D. r. raddei TT и D. r. nairensis (рис. 6,б).

Рис. 6. Кластеризация особей видов D. raddei и D. valentini на основании дискриминантного анализа главных компонент. а – число кластеров К = 3; б – число кластеров К = 4.

Обсуждение

Изучение внутривидового полиморфизма является одной из важных проблем биоразнообразия, особенно для некоторых видов позвоночных, участвующих в сетчатой эволюции. Одним из таких видов является Darevskia raddei, структура которого, несмотря на большой объем накопленной информации, до сих пор вызывает много вопросов. Особенностью данного вида является участие в качестве материнского при образовании ряда партеногенетических видов, таким образом имеющих гибридное происхождение и соответственно гибридные кариотипы [30]. При этом популяции D. r. raddei относят к материнским для партеновида D. rostombekowi, а популяции D. r. nairensis – для партеновидов D. unisexualis и D. uzzeli [6, 7]. В этой связи особую значимость получила проблема генетической дифференциации и таксономического статуса этих популяций. В различное время популяции D. r. raddei и D. r. nairensis относили к видам, подвидам или одному виду в зависимости от характера исследования, типа генетических маркеров, ареалов изучаемых популяций [31]. Ранее при использовании трех микросателлитных локусов нами были получены высокие показатели генетической дифференциации D. r. raddei и D. r. nairensis [12]. В настоящей работе они были подтверждены на расширенной популяционной выборке особей при использовании новой панели из 10 микросателлитных локусов и свидетельствуют о глубокой дивергенции этих популяций, позволяющей разделять их на подвидовые группы. Кроме того, показано, что популяции D. r. raddei характеризуются большим разнообразием по сравнению с D. r. nairensis и в свою очередь подразделены на две группы с различным составом популяций. Это свидетельствует о сложной популяционной структуре вида D. raddei в соответствии с его значительным морфологическим и цитогенетическим разнообразием [32]. В работе впервые проведен анализ индекса ассоциаций, который показал отсутствие свободной перекомбинации аллелей между подвидами, что свидетельствует об их изоляции и отсутствии скрещивания между особями.

Значение параметра G_ST= 0.36 между подвидами D. r. raddei и D. r. nairensis относительно невелико (табл. 2), несмотря на высокие показатели данного параметра при попарном сравнении групп популяций D. r. raddei GG, D. r. raddei TT и D. r. nairensis. Это может быть вызвано сходной частотой аллельных вариантов в данных группах, связанной с потоком генов между популяциями до разделения на подвиды [33]. Этим может объясняться частичное перекрывание спектров при дискриминантном анализе главных компонент.

Таким образом, в настоящей работе продемонстрирована возможность использования новых микросателлитных локусов для популяционно-генетических исследований кавказских скальных ящериц. По данным полиморфизма этих локусов подтвержден высокий уровень генетической дифференциации популяций D. r. raddei и D. r. nairensis на группы подвидового статуса. Кроме этого, отсутствие свободной перекомбинации аллелей позволяет предположить и репродуктивную изоляцию подвидов D. raddei, это в совокупности с молекулярно-генетической дифференциацией свидетельствует о глубокой их дивергенции. Новые характеристики популяционной структуры вида D. raddei связаны с обнаружением двух генетически различающихся групп популяций у самого подвида D. r. raddei, одна из которых оказалась генетически ближе другому подвиду D. r. nairensis. Выявлена достоверная кластеризация особей из популяции Гош с образцами подвида D. r. nairensis. Таким образом подтверждено генетическое сходство этих групп, ранее обсуждавшееся в ряде работ [6, 34]. Ящерицы из Южной Армении разделяются на два основных кластера, где имеются видимые различия по окраске и размерным характеристкам. Все ящерицы из популяций Зуар, Гандзасар, Тартар, Татев и Нрнадзор (группа D. r. raddei TT) отличаются наличием зеленого цвета в окраске спины и брюха, ярким паттерном рисунка и крупными размерами. В кластере D. r. raddei из популяций Гегард, Горис, Егегнадзор, Каджаран и Селимский перевал (группа D. r. raddei GG) большая часть ящериц не имеет зеленого цвета в окраске, отличается наличием больше желтого цвета на брюхе и слабым рисунком вдоль хребта, а также более мелкими размерами, особенного среди самок. У большинства из них характер фолидоза преанальной области, рисунок спины и окраска не отличаются от таковых у партеногенетического дочернего вида D. rostombekowi, что наталкивает на определенные предположения о локации материнской популяции, давшей начало данному партеновиду.

Авторы выражают благодарность В.Е. Спангенбергу за помощь в сборе биологического материала.

Исследование выполнено при поддержке гранта РНФ № 19-14-00083 и с использованием приборов ЦКП ИБГ РАН.

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Дополнительные материалы для этой статьи доступны по ссылке: doi 10.31857/S0016675824030069 для авторизованных пользователей