Methylation levels in the 5' region of the  TBX20  gene in the ascending aorta change in opposite direction in atherosclerosis and aneurysm

Yu. А. Koroleva; Королёва Ю. А.; I. A. Goncharova; Гончарова И. А.; A. А. Zarubin; Зарубин А. А.; S. А. Shipulina; Шипулина С. А.; A. A. Sleptsov; Слепцов А. А.; D. S. Panfilov; Панфилов Д. С.; В. N. Kozlov; Козлов Б. Н.; M. S. Nazarenko; Назаренко М. С.

doi:10.31857/S0016675824070091

Разнонаправленное изменение уровня метилирования CpG-сайтов в 5' регионе гена TBX20 в восходящей аорте при атеросклерозе и аневризме

Авторы: Королёва Ю.А.¹, Гончарова И.А.¹, Зарубин А.А.¹, Шипулина С.А.¹, Слепцов А.А.¹, Панфилов Д.С.¹, Козлов Б.Н.¹, Назаренко М.С.¹
Учреждения:
1. Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук
Выпуск: Том 60, № 7 (2024)
Страницы: 100-106
Раздел: КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
URL: https://journal-vniispk.ru/0016-6758/article/view/267672
DOI: https://doi.org/10.31857/S0016675824070091
EDN: https://elibrary.ru/BHIOTN
ID: 267672

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Выявлено гипометилирование пяти CpG-сайтов в 5'-регионе гена TBX20 (локус 7p14.2) в тканях атеросклеротической бляшки аорты по сравнению с ее дилатированным участком у больных с аневризмой восходящей аорты. С привлечением внешних данных мы установили, что при диссекции аорты и атеросклерозе аорты уровень метилирования ДНК региона chr7:35253926-35262250 изменяется разнонаправленно. Полученные результаты свидетельствуют об изменении эпигенетической регуляции как при атеросклеротическом поражении аорты, так и при ее аневризме.

Ключевые слова

TBX20, аневризма аорты, атеросклероз аорты, метилирование

Полный текст

Метилирование ДНК тесно связано с развитием и прогрессией сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе обусловленных атеросклеротическим поражением артерий. Опубликованные клинические и экспериментальные наблюдения показывают, что метилирование ДНК может быть вовлечено в патогенез такой жизнеугрожающей патологии как аневризма аорты (АА) [1, 2].

Между АА и атеросклеротическим поражением сердечно-сосудистой системы наблюдаются сложные взаимоотношения. С одной стороны, оба состояния имеют общие факторы риска, такие как гипертензия и курение, а наличие атеросклеротических бляшек аорты (АБА) в ее восходящем отделе считается фактором риска развития аневризмы [3, 4]. Однако, с другой стороны, в некоторых исследованиях высказано предположение о протективном эффекте аневризмы восходящего отдела грудной аорты в отношении риска развития и осложненного течения атеросклероза артерий различной локализации [5, 6]. Этот эффект может быть обусловлен не только генетическими особенностями, но и эпигенетическими модификациями, в том числе и разнонаправленным изменением метилирования каких-либо генов или их регуляторных элементов. В связи с этим интересным представлялся анализ уровня метилирования ДНК в тканях восходящей аорты и выявление его паттернов при аневризме и атеросклеротическом поражении сосуда.

Уровень метилирования ДНК был проанализирован у шести мужчин с несиндромальными спорадическими формами аневризмы восходящей аорты без сочетанного поражения аортального клапана. Возраст обследованных составил 48–64 г. У всех пациентов наблюдалась артериальная гипертензия, у четырех – ожирение, у трех – стенокардия и у одного пациента – сахарный диабет второго типа. Атеросклероз коронарных или сонных артерий (степень стеноза больше 60%) по результатам ультразвукового исследования выявлен у трех пациентов, в доклинической стадии (30%) – у двух пациентов. У трех пациентов отмечены фиброзные атеросклеротические бляшки восходящей аорты, еще у одного пациента обнаружено атеросклеротическое поражение восходящей аорты на стадии липидных полос.

Всем пациентам проведено открытое хирургическое лечение в НИИ кардиологии г. Томска в период 2020–2023 гг. У четырех пациентов взяты три фрагмента ткани аорты: атеросклеротическая бляшка дилатированной части аорты (АБА); дилатированная часть, не пораженная атеросклерозом (АА) и нерасширенная проксимальная часть дуги аорты (относительно интактная – НА). У двух пациентов не наблюдалось атеросклеротического поражения аорты, поэтому взяты только два фрагмента сосуда – АА и НА.

От всех участников было получено информированное письменное согласие на обследование. Исследование одобрено этическим комитетом Научно-исследовательского института медицинской генетики Томского национального исследовательского медицинского центра Российской академии наук (регистрационный номер 191, протокол № 13 от 15.11.2021 г.).

Метилирование ДНК оценивали методом бисульфитного секвенирования ограниченных наборов геномных локусов (RRBS). Для выполнения анализа ДНК в количестве 100 мкг на образец фрагментировали расщеплением рестриктазой Msp I (Сибэнзим). Репарацию концов и A-хвостов фрагментов ДНК осуществляли с использованием набора для подготовки библиотеки ДНК NEBNext Ultra для Illumina с последующим лигированием метилированных адаптеров (IDT) и очисткой продукта. Далее проводили отбор фрагментов размером 150–500 п.н. при помощи магнитных шариков (Agencourt AM Pure XP, Beckman Coulter). Лигированную с адаптером и очищенную ДНК обрабатывали бисульфитом натрия с помощью набора EZ DNA Methylation Kit (Zymo Research) и амплифицировали в течение 14 циклов ПЦР (NEBNext Q5U Master Mix, New EnglandBiolabs, Inc) с использованием универсальных и индексных праймеров (NEBNextMultiplexOligos для Illumina). Полученный ПЦР-продукт очищали на магнитных шариках (AgencourtAMPure XP, BeckmanCoulter). После контроля качества методом капиллярного электрофореза (Bioanalyzer 2100, Agilent) библиотеку RRBS секвенировали на приборе Illumina HiSeq1500(2 × 150 п.н.).

Результаты RRBS секвенирования были обработаны с помощью платформы DRAGEN Bio-IT v.3.9.5 (Illumina) и сопоставлены с геномом человека (сборка GRCh38). Для оценки качества использовали программу MultiQC v.1.11. На один образец приходилось 51.9 [47.4; 63.6] млн прочтений. Анализ дифференциального метилирования ДНК проводился в программной среде R с использованием пакетов methylKit и limma. Минимальное покрытие составило 10x. Дифференциально метилированными сайтами (ДМС) считались CpG-сайты с разницей среднего уровня метилирования между группами образцов |Δβ| ≥ 20% и уровнем значимости с поправкой на множественные сравнения p_FDR < 0.05.

В результате исследования было установлено гипометилирование 5 CpG-сайтов локуса 7p14.2 в тканях атеросклеротической бляшки по сравнению с участком дилатированной аорты (табл. 1). Уровень метилирования в АБА по сравнению с АА снижен на 44.1–58.4% (p_FDR < 0.05). Данные CpG-сайты расположены в 2558 п.н. друг от друга и на расстоянии 5179–7757 п.н. от 5'UTR гена TBX20 (рис. 1).

Таблица. 1. Дифференциально метилированные CpG-сайты, локализованные в 5' регионе гена TBX20 в тканях из различных отделов восходящей аорты

CpG-сайты	Локализация CpG-сайтов	Предсказанные сайты связывания ТФ (UCSC/Haploregv4.2)	SNP/MAF (GnomAD v. 4.0.0)	Уровень метилирования			Разница уровня метилирования
CpG-сайты	Локализация CpG-сайтов	Предсказанные сайты связывания ТФ (UCSC/Haploregv4.2)	SNP/MAF (GnomAD v. 4.0.0)	АБА (n = 6)	АА (n = 4)	НА (n = 4)	АБА/АА (р_FDR)	АБА/НА (р_FDR)	АA/НА (р_FDR)
chr7:35258799	Интрон гена нкРНК AC009531.2 (ENSG00000226063.1)	EBF1, Ebf2, EBF3	rs78696287/ T = 0.0001	39.4 ± 17.9	83.5 ± 4.6	46.1 ± 13.9	−44.1 (0.025)	–6.7 (–)	37.4 (0.384)
chr7:35259293	Интрон гена нкРНК AC009531.2 (ENSG00000226063.1)	ZNF528, ZNF343	Нет	20.7 ± 10.2	78.5 ± 7.4	54.5 ± 17.1	–57.8 (0.001)	–33.8 (0.241)	24.0 (0.936)
chr7:35259405	Экзон 1-го гена нкРНК AC009531.2 (ENSG00000226063.1)	IRF7, IRF8/AP-1, SETDB1, Znf143	rs78661208/ C = 0.3876	22.4 ± 11.4	70.7 ± 12.0	54.7 ± 14.9	–48.3 (0.024)	–32.3 (0.415)	16.0 (0.936)
chr7:35261291	энхансер EH38E2547742	KLF1, KLF2, KLF4, KLF5, KLF7, KLF10, KLF12, KLF14, KLF15, MAZ, PATZ1, PRDM9, SP1, SP2, SP3, SP4, SP9, FAP2A, TFAP2B, TFAP2C, Wt1, ZNF148, ZNF263, ZNF281	нет	4.8 ± 6.7	63.2 ± 5.9	32.7 ± 23.3	–58.4 (0.017)	–27.9 (0.688)	30.5 (0.936)
chr7:35261357	энхансер EH38E2547742	нет	нет	14.3 ± 5.8	69.3 ± 10.3	33.7 ± 20.0	–55.0 (0.010)	–19.4 (−)	35.6 (0.299)

Примечание. ТФ – транскрипционные факторы, SNP – однонуклеотидные полиморфизмы, MAF – частота минорного аллеля (для европеоидных популяций), GеnomAD – база данных генетических вариантов (https://gnomad.broadinstitute.org/), UCSC – геномный браузер UniversityofCaliforniaSantaCruz (https://genome.ucsc.edu/), Haploreg – программа по функциональному анализу генетических вариантов и их расположению в гаплотипах (https://pubs.broadinstitute.org/mammals/haploreg/haploreg.php), р_FDR – уровень значимости p с поправкой на множественные сравнения (FalseDiscoveryRate), АБА – атеросклеротическая бляшка дилатированной части аорты, АА – дилатированная часть аорты, не пораженная атеросклерозом, НА – нерасширенная проксимальная (относительно интактная) часть дуги аорты, нкРНК – некодирующая РНК.

Рис. 1. Локализация и эпигенетический контекст исследуемой 5'-области гена TBX20. Тонкими цветными вертикальными линиями отмечены пять ДМС между атеросклеротической бляшкой дилатированной части аорты, не пораженной атеросклерозом, дилатированной частью аорты и нерасширенной проксимальной частью аорты (данное исследование). Широкими вертикальными полосами обозначены: желтым – регионы, гипометилированные в тканях миокарда при тетраде Фалло [18, 19], голубым – регионы, гипометилированные в тканях аорты при атеросклерозе [17]. Различия по уровню метилирования между непораженными тканями аорты и атеросклеротически измененной аортой для трех регионов (слева направо) составили 41, 29 и 30%. Красные горизонтальные линии обозначают регионы гиперметилированных CpG-сайтов при диссекции аорты (GSE84274 [8]), синие горизонтальные линии – регионы гипометилированных CpG-сайтов при атеросклерозе аорты по сравнению с непораженной тканью аорты (GSE46394 [8]). Все треки получены и/или выровнены на UCSC GenomeBrowser (сборка генома GRCh38).

Согласно геномному браузеру UCSC [7], четыре из выявленных нами дифференциально метилированных CpG-сайтов приходятся на сайты связывания транскрипционных факторов (ТФ) (табл. 1). При этом число ТФ, способных связываться с областью, включающей конкретный CpG-сайт, варьирует от 2 (для chr7:35259293) до 24 (для chr7:35261291). Кроме этого, два CpG-сайта локализованы непосредственно в последовательности энхансера EH38E2547742 и три в области гена нкРНК ENSG00000226063 (табл. 1, рис. 1). Один из ДМС (chr7:35259405) представляет собой однонуклеотидный полиморфизм с высокой частотой минорного аллеля среди представителей европейской популяции (rs78661208, MAF C = 0.3876).

Учитывая то, что между группами АA и НА, а также АБА и НА различия в уровне метилирования отдельных CpG-сайтов превышали 20% (однако группы сравнения были малы по размеру), мы рассмотрели внешние данные по анализу метилирования ДНК с помощью метилочипов Illumina в тканях восходящей аорты при ее диссекции (n = 12) по сравнению с нормальной тканью аорты (n = 6) (датасет GSE84274, загружен из базы данных GEO [8]), а также атеросклерозе аорты (n = 15) по сравнению с непораженной тканью (n = 15) (датасет GSE46394), загружен из базы данных GEO [8]).

При диссекции аорты в отдельных CpG-сайтах региона chr7:35253926-35262250 выявлено статистически значимое гиперметилирование (разница уровня метилирования по сравнению с непораженной тканью составляла от 1.39 до 17.70%), при этом гиперметилированные сайты группировались в три региона (рис. 1) (GSE84274 [8]). При атеросклерозе аорты, напротив, выявлены три региона, в которых CpG-сайты были гипометилированы (с разницей уровня метилирования от –3.16 до –15.50%) по сравнению с непораженной тканью аорты (GSE46394 [8]) (рис. 1). Таким образом, при диссекции аорты и атеросклерозе аорты уровень метилирования ДНК региона chr7:35253926-35262250 (в области генов нкРНК ENSG00000289335 и ENSG00000226063) изменяется разнонаправленно.

Ген TBX20 является членом подсемейства Tbx1 Т-бокс-содержащих генов, контролирующих различные факторы транскрипции, необходимые для эмбрионального развития и органогенеза. Tbx20 важен для развития сердечно-сосудистой системы и участвует в ремоделировании сердца в ответ на патофизиологические стрессы [9]. Редкие патогенные варианты TBX20 у человека ассоциированы со сложным спектром врожденных пороков сердца, включающим дефекты формирования перегородок и клапанов, коарктацию аорты, а также с аневризмой грудной аорты в сочетании с двустворчатым аортальным клапаном [10–12]. В исследованиях GWAS в области гена TBX20 выявлены 16 частых SNP, ассоциированных с диаметром восходящей аорты, аневризмой аорты и атеросклерозом сонных и коронарных артерий [13].

Как генетические варианты, так и изменение эпигенетической регуляции, включая метилирование генов, связанных с развитием сосудистой системы и сердца (в том числе таких, как Т-бокс-содержащие гены), могут способствовать нарушению целостности аорты и патогенезу аневризмы [2]. Высокая функциональная активность гена TBX20 выявлена в фибробластах и гладкомышечных клетках аорты у пациентов с аневризмой восходящей аорты и контрольной группы [14, 15]. В то же время данные по изменению метилирования в области гена TBX20 в клетках и тканях восходящей аорты при ее аневризме отсутствуют.

Также мало изучена роль TBX20 в развитии атеросклероза артерий различной локализации. Однако недавно с помощью технологии секвенирования транскриптома отдельных клеток была выявлена преимущественная экспрессия TBX20 в гладкомышечных клетках и фибробластах пораженных атеросклерозом коронарных артерий человека. Более того, показано, что в гладкомышечных клетках и фибробластах область данного гена “насыщена” участками открытого хроматина [16]. Ранее в тканях грудной аорты, пораженных атеросклерозом, относительно непораженной ткани были выявлены несколько протяженных гипометилированных областей, затрагивающих 5'-UTR гена TBX20 [17].

Результаты настоящего исследования согласуются с представленными выше, поскольку гипометилированные в атеросклеротической бляшке аорты CpG-сайты локализуются в том же регионе или непосредственной близости от него (рис. 1). Показано, что и промоторная область гена TBX20, находящаяся в 5000–8000 п.н. от изученного в данном исследовании региона, гипометилирована в тканях миокарда при тетраде Фалло [18, 19]. Выявленные в настоящем исследовании гипометилированные в атеросклеротической бляшке аорты CpG-сайты локализованы в регионе концентрации регуляторных элементов, в частности энхансеров, и являются сайтами связывания различных ТФ. В частности, среди ТФ, предположительно способных связываться с областью CpG-сайта chr7:35261291, отмечен SP1, который способствует активации гена TBX20. Можно предположить, что снижение метилирования данного сайта при атеросклерозе аорты приведет к повышению активности гена TBX20 в клетках атеросклеротической бляшки (преимущественно в гладкомышечных клетках и фибробластах). Это предположение косвенно подтверждается данными о повышении экспрессии гена TBX20 при снижении уровня метилирования другого сайта связывания ТФ SP1 в области промотора TBX20 в тканях миокарда при тетраде Фалло [19].

В настоящем исследовании показано, что ДМС chr7:35259405 является полиморфным сайтом с достаточно высокой частотой (36%) в европеоидных популяциях (табл. 1). Поскольку метилированию в ДНК подвергается цитозин, в случае однонуклеотидных полиморфизмов замена нуклеотида может приводить к утрате существующего или формированию нового сайта метилирования. Для установления роли однонуклеотидных полиморфизмов, а также участков связывания с транскрипционными факторами в данном локусе генома требуется проведение дополнительных исследований.

Таким образом, в данном исследовании выявлено гипометилирование пяти CpG-сайтов, расположенных на расстоянии примерно 5000 п.н. от гена TBX20 (в области гена нкРНК ENSG00000226063), в тканях атеросклеротической бляшки аорты по сравнению с ее дилатированным участком у больных с аневризмой восходящей аорты. В то же время показано, что при диссекции аорты и атеросклерозе аорты уровень метилирования ДНК региона chr7:35253926-35262250 (в области генов нкРНК ENSG00000289335 и ENSG00000226063) изменяется разнонаправленно. Полученные результаты свидетельствуют об изменении эпигенетической регуляции как при атеросклеротическом поражении аорты, так и при ее аневризме и выступают подтверждением возможной роли гена TBX20 и генов нкРНК в процессах атерогенеза у лиц с аневризмой восходящей аорты и аортальным клапаном нормального строения.

Исследование выполнено за счет гранта РНФ № 22-25-00701.

Исследование одобрено Этическим комитетом Научно-исследовательского института медицинской генетики Томского национального исследовательского медицинского центра Российской академии наук – протокол № 13 от 15 ноября 2021 г., а также Этическим комитетом Научно-исследовательского института кардиологии Томского национального исследовательского медицинского центра Российской академии наук – протокол № 213 от 12 мая 2021 г.

Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики. От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие. Все обследованные – совершеннолетние.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.