Molecular genetic аnd meiotic peculiarities оf Caucasus pine vole Microtus (Terricola) daghestanicus in the eastern part of the Greater Caucasus

Мұқаба

Дәйексөз келтіру

Толық мәтін

Аннотация

The high level of karyotypic and molecular genetic variability was previously detected in the Caucasus pine vole Microtus daghestanicus. However, populations of this species were poorly studied in the eastern part of the Greater Caucasus. To reveal their genetic peculiarities and phylogenetic relationships with other conspecific populations we analyzed a sample of Caucasus pine voles from the south of the Chechen Republic (Daikhokh Mount). The immunocytochemical study of synaptonemal complexes in meiotic prophase I demonstrated that the population belongs to the most distributed 54-chromosomal form of M. daghestanicus. The entire mitochondrial cytochrome b gene analysis showed close clustering specimens from Chechen Republic and previously studied Caucasus pine vole from northern Georgia. It indicates that all these specimens belong to a discrete genetic form. In the studied sample from Chechen Republic we revealed variability of the nuclear BRCA1 and XIST genes that probably reflects a complicated history of the population associated with alternation of its isolation from neighbor populations and restoring contacts between them.

Толық мәтін

Виды животных, населяющие высокогорья, представляют собой весьма интересные объекты для изучения генетического полиморфизма и дифференциации. Фрагментарность местообитаний, пригодных для жизни, экстремальные климатические условия и наличие разнообразных труднопреодолимых ландшафтных преград (горных рек, ледников, оползней и пр.), способствующих периодической изоляции популяций, способны значительно ускорить процесс накопления мутаций из-за сокращения эффективной численности особей, а также привести к неравномерной скорости эволюции разных генетических структур – хромосомных наборов, ядерных и митохондриальных геномов. Наиболее зависимы от сложных ландшафтно-климатических условий высокогорий виды, имеющие в силу своей биологии ограниченную способность к быстрым миграциям, например, обитающие под землeй постоянно или значительную часть времени [1, 2].

Дагестанская полевка Microtus daghestanicus Shidlovsky, 1919 – один из представителей подрода кустарниковых полевок Terricola Fatio, 1867, ведущих полуподземный образ жизни. Этот вид обитает на Северном Кавказе и в Закавказье, населяет луга субальпийского пояса гор и характеризуется значительной кариотипической и молекулярно-генетической изменчивостью. У M. daghestanicus выявлено 11 кариоморф (2n = 54, 53, 52, 46, 45, 44, 43, 42“А”, 42“В”, 40, 38; NF = 58), которые возникли в результате робертсоновских транслокаций хромосом [3, 4]. Зона хромосомной изменчивости охватывает, однако, лишь южную часть ареала вида (юг Закавказья), кроме одной формы с 2n = 52, обнаруженной на западе Дагестана [4, 5]. Хромосомные формы 2n = 38 и 42“А” с Карабахского и Зангезурского хребтов Закавказья, соответственно, предлагалось рассматривать в качестве самостоятельного вида M. nasarovi Shidlovsky, 1938 [5, 6].

Ранее молекулярно-генетический анализ митохондриального гена цитохрома b (cytb) показал дифференциацию M. daghestanicus по крайней мере на четыре внутривидовые группы, несмотря на их сходство по кариотипу (2n = 54): одна из них выявлена в западной части Северного Кавказа (в Кабардино-Балкарии и Карачаево-Черкесии), другая – в центральной части Северного Кавказа (в Северной Осетии), третья была представлена единственным экземпляром из Северной Грузии, а четвертая – популяциями Малой Азии [7]. Исследование фрагментов трех ядерных генов – BRCA1 (breast and ovarian cancer susceptibility protein 1, экзон 11), IRBP (interphotoreceptor retinoid-binding protein, экзон 1) и XIST (X-inactive specific transcript) – подтвердило генетическое своеобразие лишь дагестанских полевок из Северной Осетии. Все прочие популяции M. daghestanicus показали изменчивость, не имеющую отчетливой связи с их географическим происхождением. Однако неожиданное выявление заметной внутрипопуляционной изменчивости генов BRCA1 и XIST у экземпляров из Кабардино-Балкарии и Северной Осетии (наряду с обилием особей, гетерозиготных по ряду нуклеотидных сайтов), может указывать на активный обмен особями и генами между соседними популяциями в указанных регионах Кавказа [7, 8].

Тем не менее, для значительной части ареала M. daghestanicus (особенно территории Северного Закавказья и восточной части Северного Кавказа) имеются лишь отрывочные данные по единичным экземплярам и отдельным маркерам [4, 7, 9], что существенно усложняет оценку характера изменчивости вида и доказательство дискретности выявленных молекулярно-генетическими методами внутривидовых форм дагестанской полевки. Для решения этой проблемы необходимо изучение дополнительного материала. Весьма скудные сведения имеются и в отношении особенностей мейоза у особей M. daghestanicus: опубликовано лишь электронно-микроскопическое описание профазы I у гибридов 38-хромосомной и 48-хромосомной форм, без изучения родительских особей [4, 10].

Цель настоящей работы – молекулярно-генетический анализ полиморфизма и филогенетических связей одной из популяций M. daghestanicus из восточной части Северного Кавказа, а также иммуноцитохимическое исследование сперматоцитов данных животных.

Материалом для данной работы послужили 4 экземпляра M. daghestanicus, №№ Т23-01 (♂), Т23-19 (♀), Т23-20 (♂), Т23-21 (♀), отловленные в 2023 г. на горе Дайхох, в Шатойском р-не Чеченской Республики. Впервые для “чистых” кариоморф данного вида, из семенников обоих самцов были получены препараты хромосом на стадии пахитены профазы I мейоза и проведены исследования синаптонемных комплексов (СК) – мультибелковых комплексов, соединяющих гомологичные хромосомы на данном этапе мейотического деления [11]. Получение СК в распластанных ядрах сперматоцитов выполнялось по стандартной методике [12] с некоторыми модификациями [13]. Процедура иммуноцитохимического окрашивания была идентична ранее описанной [14]. Тотальная ДНК была получена от всех особей из фиксированных в этаноле измельченных образцов печени или сердца после их обработки протеиназой К, фенол-хлороформной депротеинизации и последующего осаждения изопропанолом [15]. Праймеры, применявшиеся для амплификации и секвенирования полного гена cytb (1143 пн), двух перекрывающихся фрагментов экзона 11 гена BRCA1 с итоговой протяженностью 1698 пн и двух неперекрывающихся участков гена XIST (413 и 585 пн), которые впоследствии были объединены и проанализированы как единая последовательность (998 пн), а также условия проведения ПЦР и статистической обработки полученных данных, идентичны опубликованным ранее [7]. Кроме того, в анализ были включены все доступные в базе GenBank последовательности перечисленных генов дагестанских полевок, а также двух подземных полевок M. subterraneus и двух кустарниковых полевок M. majori в качестве аутгруппы [7, 9]. Построение дендрограмм по методу Maximum Likelihood (ML) выполнено с помощью компьютерной программы IQTree, версия 2.0-rc2 [16], а обработка их изображений – с помощью программы FigTree 1.4.3 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/). Данное исследование проводится в рамках Государственных заданий № 0088-2024-0011 (ИБР РАН) и № 0092-2022-0002 (ИОГен РАН). При выполнении экспериментальной работы нами использовалось оборудование “Сектора анализа генома” в составе ЦКП “Группа геномных технологий” (ИБР РАН) и ЦКП ОБН РАН “Генетический полиморфизм”.

Иммуноцитохимический анализ выявил 26 СК аутосом и асинаптические половые хромосомы, X и Y (рис. 1). Благодаря идентификации центромер было установлено, что 25 СК и Y являются акроцентриками, Х-хромосома – крупный субметацентрик, а аутосомы самой маленькой пары (№ 26) – метацентрики (рис. 1,б, г). Данный набор хромосом определяет количество хромосомных плеч NF = 58. Примечательно, что некоторые участки хроматина между СК окрашивались “центромерными” антителами (рис. 1,г).

Анализ изменчивости гена cytb (рис. 2,а) показал, что особи M. daghestanicus из Чечни объединяются на филогенетическом древе в одну отчетливую, компактную кладу вместе с дагестанской полевкой из Северной Грузии. Несмотря на умеренную генетическую р-дистанцию (0.022) между этой кладой и “сестринской”, объединяющей экземпляры M. daghestanicus из Северной Осетии, обе имеют высокую бутстреп-поддержку (99–100%). По ядерным генам получены противоречивые данные: по гену XIST три из четырех дагестанских полевок с горы Дайхох объединились с североосетинскими (рис. 2,б). По гену BRCA1 все изученные особи из Чечни оказались сходными с большинством конспецифичных экземпляров из западной части Северного Кавказа (рис. 2,в). Интересно, что как по гену XIST, так и по гену BRCA1 проявляется заметная изменчивость выборки из Чечни, несмотря на малочисленность составляющих ее животных.

 

Рис. 1. Распластанное ядро сперматоцита дагестанской полевки M. daghestanicus (№ Т23-01), стадия пахитены. Проведена иммунодетекция белка латеральных элементов СК – SYCP3 (а), белка кинетохор (центромеры) с помощью антител CREST (б). Хроматин окрашен DAPI (в). Совмещенное изображение белков SYCP3 и центромеры представлено отдельно (г). Некоторые участки хроматина между СК являются CREST-позитивными (отмечены стрелками). Масштаб – 5 мкм.

 

Итак, благодаря анализу СК, который позволяет определить количество хромосом и уточнить их морфологию [17], нами для кариотипов дагестанских полевок из Чечни были впервые установлены диплоидное число (2n = 54) и количество хромосомных плеч (NF = 58), что соответствует большинству популяций этого вида на Северном Кавказе. Дагестанская полевка относится к тем многочисленным видам полевочьих, у которых выявлены асинаптические половые хромосомы [18], такие же, как и обнаруженные ранее у особей M. daghestanicus с “гибридным” кариотипом [4, 10]. Таким образом, асинапсис половых хромосом – это видовая характеристика, а не проявление гибридной стерильности. Необычное соединение “центромерных” антител с участками хроматина между СК, вероятно, связано с некоторыми его формами или конформациями, поскольку известно, что белок CENP-A является центромерным вариантом гистона H3 [19].

Несмотря на отсутствие кариотипической изменчивости во всех популяциях, которые были исследованы молекулярно-генетическими методами, дагестанские полевки, отловленные в Чечне на горе Дайхох, продемонстрировали отчетливое своеобразие по митохондриальной ДНК. Так как они образуют единый кластер вместе с экземпляром из Северной Грузии – из локалитета, географически достаточно удаленного от Чеченской Республики, можно с большой вероятностью предполагать, что в данном случае мы имеем дело не с индивидуальной изменчивостью или особенностью отдельной популяции, а с обособленной генетической формой, имеющей сравнительно широкое распространение. Генетическая структура вида по ядерным генам прослеживается менее отчетливо, по-видимому, из-за меньшей скорости их эволюции в сравнении с митохондриальным геномом. Однако полиморфизм генов XIST и BRCA1 в изученной популяции дагестанских полевок из Чечни может отражать ее сложную историю, связанную с чередованием этапов изоляции от соседних популяций и возобновлением контактов между ними. Похожий сценарий предполагался ранее для других популяций M. daghestanicus Северного Кавказа и Малой Азии [7, 8].

 

Рис. 2. ML-дендрограммы, построенные при сравнении дагестанских полевок из разных популяций и нескольких особей M. subterraneus и M. majori по полной последовательности митохондриального гена cytb (a), объединенной последовательности двух неперекрывающихся фрагментов ядерного гена XIST (б) и фрагменту 11-го экзона ядерного гена BRCA1 (в). В узлах ветвления древ даны значения бутстреп-индекса, превышающие 70%. Для ранее опубликованных последовательностей указаны номера базы GenBank; номера без дополнительных обозначений взяты из публикации [7], номера, отмеченные звездочкой – из статьи [9]. Для гена XIST через запятую представлены номера, соответствующие его первому и второму отдельно просеквенированным фрагментам.

 

Авторы глубоко признательны Сапарбаевой Ларисе Маасовне (КНИИ РАН) за помощь в лабораторной обработке материала.

Настоящая работа выполнена при финансовой поддержке Российского Научного Фонда (грант № 23-24-00329).

Все применимые международные, национальные и/или институциональные принципы ухода за животными и их использования были соблюдены.

Исследование одобрено Этическим комитетом ИБР РАН (протокол № 37 от 25.06.2020).

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

×

Авторлар туралы

A. Bogdanov

Koltzov Institute of Developmental Biology, Russian Academy of Sciences

Email: sergey8585@mail.ru
Ресей, Moscow, 119334

M. Atsaeva

Ibragimov Complex Institute of the Russian Academy of Sciences; Vavilov Institute of General Genetics, Russian Academy of Sciences

Email: sergey8585@mail.ru
Ресей, Grozny, 344051; Moscow, 119991

D. Arsanukaev

Severtsov Institute of Ecology and Evolution, Russian Academy of Sciences

Email: sergey8585@mail.ru
Ресей, Moscow, 119071

S. Matveevsky

Vavilov Institute of General Genetics, Russian Academy of Sciences

Хат алмасуға жауапты Автор.
Email: sergey8585@mail.ru
Ресей, Moscow, 119991

Әдебиет тізімі

  1. Tambovtseva V., Bakloushinskaya I., Matveevsky S., Bogdanov A. Geographic mosaic of extensive genetic variations in subterranean mole voles Ellobius alaicus as a consequence of habitat fragmentation and hybridization // Life. 2022. V. 12. https://doi.org/10.3390/life12050728
  2. Bogdanov A., Tambovtseva V., Matveevsky S., Bakloushinskaya I. Speciation on the roof of the World: parallel fast evolution of cryptic mole vole species in the Pamir-Alay–Tien Shan region // Life. 2023. V. 13. https://doi.org/10.3390/life13081751
  3. Ляпунова Е.А., Ахвердян М.Р., Воронцов Н.Н. Робертсоновский веер изменчивости хромосом у субальпийских полевок Кавказа (Pitymys: Microtinae, Rodentia) // ДАН СССР. 1988. Т. 298. С. 480–484.
  4. Ахвердян М.Р., Ляпунова Е.А., Воронцов Н.Н. Кариология и систематика кустарниковых полевок Кавказа и Закавказья (Terricola, Arvicolinae, Rodentia) // Зоол. журнал. 1992. Т. 71. Вып. 3. С. 96–110.
  5. Хатухов А.М., Дзуев Р.И., Темботов А.К. Новые кариотипические формы кустарниковых полевок (Pitymys) Кавказа // Зоол. журнал. 1978. Т. 57. Вып. 10. С. 1566–1570.
  6. Загороднюк И.В. Кариотип, систематическое положение и таксономический статус Pitymys ukrainicus (Rodentia) // Вестник зоологии. 1988. № 4. С. 50–55.
  7. Bogdanov A.S., Khlyap L.A., Kefelioğlu H. et al. High molecular variability in three pine vole species of the subgenus Terricola (Microtus, Arvicolinae) and plausible source of polymorphism // J. Zool. Syst. Evol. Res. 2021. V. 59. I. 8. P. 2519–2538. https://doi.org/10.1111/jzs.12539
  8. Богданов А.С., Хляп Л.А., Баскевич М.И. Дифференциация и филогенетические связи трех видов полевок подрода Terricola (Rodentia, Arvicolinae, Microtus): результаты анализа фрагментов ядерных генов BRCA1 и XIST // Известия РАН. Серия биол. 2020. № 6. С. 575–580. https://doi.org/10.31857/S0002332920060028
  9. Jaarola M., Martínková N., Gűndűz İ. et al. Molecular phylogeny of the speciose vole genus Microtus (Arvicolinae, Rodentia) inferred from mitochondrial DNA sequences // Mol. Phylogen. and Evol. 2004. V. 33. P. 647–663. https://doi.org/10.1016/j.ympev.2004.07.015
  10. Малыгин В.М., Левенкова Е.С., Ахвердян М.Р., Сафронова Л.Д. Сравнение синаптонемных комплексов самцов-гибридов кавказских кустарниковых полевок (Rodentia, Microtinae, Terricola) в контексте изучения гибридной стерильности // Зоол. журнал. 2000. Т. 79. Вып. 3. С. 348–356.
  11. Богданов Ю.Ф., Коломиец О.Л. Синаптонемный комплекс – индикатор динамики мейоза и изменчивости хромосом. М.: Т-во научн. изданий КМК, 2007. 358 c.
  12. Peters A.H.F.M., Plug A.W., van Vugt M.J., de Boer P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germ line // Chromosome Res. 1997. V. 5. P. 66–71. https://doi.org/10.1023/A:1018445520117
  13. Page J., Berríos S., Rufas J.S. et al. The pairing of X and Y chromosomes during meiotic prophase in the marsupial species Thylamys elegans is maintained by a dense plate developed from their axial elements // J. Cell Sci. 2003. V. 116. P. 551–560. https://doi.org/10.1242/jcs.00252
  14. Matveevsky S., Chassovnikarova T., Grishaeva T. et al. Kinase CDK2 in mammalian meiotic prophase I: Screening for hetero- and homomorphic sex chromosomes // Int. J. Mol. Sci. 2021. V. 22. https://doi.org/10.3390/ijms22041969
  15. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. N. Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989. 398 p.
  16. Minh B.Q., Trifinopoulos J., Schrempf D., Schmidt H.A. IQ-TREE version 2.0: Tutorials and manual phylogenomic software by maximum likelihood. 2019, december 1. http://www.iqtree.org
  17. Богданов Ю.Ф., Коломиец О.Л. Кариотипирование на основе синаптонемных комплексов и применение этого метода в цитогенетике // Генетика. 1985. Т. 21. № 5. С. 793–802.
  18. Borodin P.M., Basheva E.A., Torgasheva A.A. et al. Multiple independent evolutionary losses of XY pairing at meiosis in the grey voles // Chrom. Res. 2012. V. 20. P. 259–268. https://doi.org/10.1007/s10577-011-9261-0
  19. Earnshaw W.C., Allshire R.C., Black B.E. et al. Esperanto for histones: CENP-A, not CenH3, is the centromeric histone H3 variant // Chrom. Res. 2013. V. 21. P. 101–106. https://doi.org/10.1007/s10577-013-9347-y

Қосымша файлдар

Қосымша файлдар
Әрекет
1. JATS XML
Жүктеу
2. Fig. 1. The sprawled nucleus of the spermatocyte of the Dagestan vole M. daghestanicus (No. T23-01), the pachytene stage. Immunodetection of the protein of the lateral elements of SC – SYCP3 (a), kinetochore protein (centromeres) was performed using CREST antibodies (b). Chromatin was stained with DAPI (c). The combined image of the SYCP3 and centromere proteins is presented separately (d). Some areas of chromatin between the SC are CREST-positive (marked with arrows). The scale is 5 microns.

Жүктеу (334KB)
Метадеректер
3. Fig. 2. ML-dendrograms constructed when comparing Dagestan voles from different populations and several individuals of M. subterraneus and M. majori according to the complete sequence of the cytb mitochondrial gene (a), the combined sequence of two non-overlapping fragments of the XIST nuclear gene (b) and a fragment of the 11th exon of the BRCA1 nuclear gene (c). In the nodes tree branches are given bootstrap index values exceeding 70%. For previously published sequences, GenBank database numbers are indicated; numbers without additional designations are taken from the publication [7], numbers marked with an asterisk are from the article [9]. For the XIST gene, the numbers corresponding to its first and second separately sequenced fragments are separated by commas.

Жүктеу (1MB)
Метадеректер

© Russian Academy of Sciences, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».