Email this article Expression of heterologous PEP-carboxylase in Methylococcus capsulatus MIR: the influence on growth characteristics and amino acid composition of methanotrophic biomass
- Authors: But S.Y.1,2, Rozova O.N.1,2, Chistyakova S.V.2, Potapova D.S.3, Khmelenina V.N.2, Mustakhimov I.I.1,2
-
Affiliations:
- Research Center of Biotechnology, Russian Academy of Sciences
- Pushchino Scientific Center for Biological Research, Russian Academy of Sciences
- Tula State University
- Issue: Vol 93, No 6 (2024)
- Pages: 879-883
- Section: SHORT COMMUNICATIONS
- URL: https://journal-vniispk.ru/0026-3656/article/view/276185
- DOI: https://doi.org/10.31857/S0026365624060173
- ID: 276185
Cite item
Full Text
Abstract
Methylococcus capsulatus MIR is a strain of methanotrophic bacteria that is potentially suitable for producing feed protein and other value-added products from methane. Genomic analysis did not reveal in Mc. capsulatus MIR known pathways of C3-carboxylation, necessary for the replenishment of intermediates of the tricarboxylic acid cycle and the full functioning of metabolism. The pepc gene encoding PEP carboxylase in Methylomonas rapida 12 was introduced into Mc. capsulatus MIR cells on a plasmid under the control of a medium-strength promoter. Expression of heterologous PEP carboxylase led to an increase in the content of glutamate, glycine and lysine in the cells of the recombinant strain, but did not increase to the growth rate of the culture. Consequently, the introduction of heterologous PEP carboxylase, which carries out the C3-carboxylation reaction, helps to increase the nutritional value of the methanotroph biomass.
Full Text
Метан является вторым по распространенности после диоксида углерода парниковым газом. При этом концентрация метана в атмосфере в последнее время выросла до угрожающих значений, что вносит значительный вклад в глобальное потепление (Schaefer et al., 2016; Tollefson, 2022). Одним из основных источников метана является попутный газ, выделяемый при добыче нефти, который в настоящее время большей частью не используется, а просто сжигается. Аэробные метанотрофы – специализированная группа бактерий, использующих метан и метанол в качестве источников углерода и энергии (Hanson, Hanson, 1996). Благодаря способности синтезировать из метана все клеточные компоненты, метанотрофы рассматриваются в качестве биокатализаторов при получении широкого спектра органических соединений (Henard et al., 2016; Strong et al., 2016). Термотолерантный метанотроф Methylococcus capsulatus MIR, выделенный из ила городских очистных сооружений Иркутска, обладает высокой скоростью роста при 42°С и перспективен в качестве продуцента кормового белка (Oshkin et al., 2022).
Анализ доступных геномов метанотрофов рода Methylococcus не выявил гены, кодирующие известные ферменты С3-карбоксилирования (Oshkin et al., 2021). Вместе с тем данные анаплеоротические реакции важны в метаболизме бактерий, поскольку восполняют пул соединений, образующихся в цикле трикарбоновых кислот (ЦТК) и расходующихся на синтез аминокислот и вторичных метаболитов. Метанотрофы I типа используют рибулозомонофосфатный цикл в качестве основного пути ассимиляции С1-соединений. Кроме того, у этих бактерий присутствуют гены серинового пути, который, однако, считается неполным из-за отсутствия генов фосфоенолпируват (ФЕП) карбоксилазы ‒ одного из ключевых ферментов серинового пути (But et al., 2019). Единственным исключением из этой закономерности являются метанотрофы рода Methylomonas, поскольку в их геномах имеется полный набор генов серинового цикла. У других метанотрофов I типа, в частности, у Methylotuvimicrobium alcaliphilum 20Z, имеются пируваткарбоксилаза и ФЕП-карбоксикиназа, по-видимому, выполняющие функцию восполнения оксалоацетата – предшественника аминокислот аспартатной группы. Ранее было обнаружено, что сверхэкспрессия С3 карбоксилаз может улучшать ростовые характеристики гетеротрофных бактерий за счет увеличения потока углерода в ЦТК (Koffas et al., 2003; Buch et al., 2010). Аналогичный эффект можно ожидать для метанотрофов.
Целью данной работы являлось изучение влияния экспрессии гетерологичной ФЕП-карбоксилазы из Methylomonas rapida 12 на ростовые характеристики и накопление аминокислот у термотолерантного метанотрофа M c. capsulatus MIR.
Mc. capsulatus MIR выращивали на среде П (Хмеленина и соавт., 1994) в атмосфере метана и воздуха при 42°С. Для сверхэкспрессии ФЕП-карбоксилазы была создана плазмида, в которой ген pepc из Methylomonas rapida 12 находился под контролем промотора PphaC из Cupriavidus necator H16. Ранее PphaC зарекомендовал себя как промотор средней силы при использовании в клетках Mc. capsulatus (Rumah et al., 2023). Полученную плазмиду pAWP-pepc вводили в клетки Mc. capsulatus MIR с помощью конъюгации со штаммом E. coli S-17-1. Трансконъюганты отбирали на среде П, содержащей 25 мкг/мл канамицина. Для получения рекомбинантной ФЕП-карбоксилазы ген pepc клонировали в экспрессионном векторе pET28b(+), полученной плазмидой трансформировали штамм E. coli Rosetta (DE3). Клетки, несущие плазмиду, выращивали на среде LB до ОП600 ~ 0.6, индукцию экспрессии осуществляли с помощью добавления изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ) до концентрации 0.5 мМ и инкубацией в течение ночи при 18°С. Рекомбинантный фермент очищали на колонке с Ni-NTA-агарозой (“Quiagen”, Германия), элюируя градиентом имидазола. Активность ФЕП-карбоксилазы измеряли спектрофотометрически при 340 нм в реакционной смеси, содержавшей 50 мМ MOPS-KOH (рН 9.0), 5 мМ MgCl2, 5 мМ KHCO3, 3 мМ НАДН, 5 Е малатдегидрогеназы из Methylosinus trichosporium OB3b (Розова и соавт., 2019). Для измерения содержания аминокислот Mc. capsulatus MIR/pAWP-pepc выращивали в качалочных колбах с 200 мл среды П, содержавшей 25 мкг/мл канамицина. Колбы заполняли смесью метан‒воздух (1 : 1), культивировали при 42°С в течение 2 сут. В качестве контроля использовали клетки, несущие плазмиду pAWP-PphaC без гена pepc. Биомассу собирали, лиофилизировали, метаболиты экстрагировали 80%-м хлороформом. Экстракты упаривали досуха, растворяли в воде, несколько раз экстрагировали метанолом, водную фракцию использовали для анализа аминокислот. Анализ проводили на колонке Reprosil OPA (“Dr. Maisch”, Германия), как описано ранее (But et al., 2020).
Функциональность ФЕП-карбоксилазы из Methylomonas methanica 1 2 была доказана с помощью гетерологичной экспрессии в E. coli. Фермент катализировал карбоксилирование ФЕП до оксалоацетата в присутствии бикарбонат-ионов. Максимальную активность рекомбинантная ФЕП-карбоксилаза проявляла при 45°С и рН 9.0. Активность фермента в 2.5 раза стимулировалась внесением в реакционную смесь пирувата. Фермент подчинялся кинетике Хилла. В присутствии 1 мМ пирувата активность фермента (Vmax) составила 22.2 ± 0.6 Е/мг белка, а значение S0.5 для ФЕП – 0.26 ± 0.02 мМ. Пируват является одним из центральных метаболитов у метанотрофов I типа. Повышение активности и аффинности к субстрату ФЕП-карбоксилазы из Mm. methanica 12 в присутствии пирувата делают данный фермент удачным выбором для создания синтетического анаплеротического пути у Mc. capsulatus MIR.
Гетерологичная экспрессия ФЕП-карбоксилазы в Mc. capsulatus MIR не привела к увеличению скорости роста по сравнению с контрольным штаммом, несущим пустой вектор (рис. 1), при этом штамм, несущий ген pepc, накапливал меньше биомассы. Анализ свободных аминокислот выявил повышение уровня глутамата, глицина и лизина (рис. 2).
Рис. 1. Кривые роста штаммов MIR/pAWP-Pphac (1) и MIR/pAWP-pepc (2).
Рис. 2. Накопление аминокислот клетками штаммов MIR/pAWP-Pphac (1) и MIR/pAWP-pepc (2). Бары представляют стандартное отклонение для трех независимых экспериментов. Для определения статистической значимости различий использовали тест Стьюдента; *p < 0.05.
Данный результат является логичным, поскольку лизин и глутамат синтезируются из интермедиатов ЦТК – оксалоацетата (через аспартат) и 2-оксоглутарата соответственно. Примечательно, что при этом содержание аспартата в клетках модифицированного штамма не изменилось, что, возможно, связано с оттоком аминокислоты на биосинтез. Особый интерес представляет увеличение содержания лизина. Поскольку данная аминокислота является незаменимой, биомасса, обогащенная лизином, имеет повышенную ценность с биотехнологической точки зрения. Экспрессия ФЕП-карбоксилазы не повлияла на скорость роста, что можно объяснить тем фактом, что, в отличие от гетеротрофных бактерий (Koffas et al., 2003; Buch et al., 2010), ЦТК у метанотрофов не является основным источником энергии, а значительная часть восстановительных эквивалентов образуется при последовательном окислении метана до СО2.
ФИНАНСИРОВАНИЕ
Работа выполнена в рамках проекта “Развитие технологий геномного редактирования для решения инновационных задач промышленных и пищевых биотехнологий” № 075-15-2021-1071, финансируемого Министерством науки и высшего образования РФ.
СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ
Настоящая статья не содержит результатов исследований с использованием животных в качестве объектов.
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
About the authors
S. Y. But
Research Center of Biotechnology, Russian Academy of Sciences; Pushchino Scientific Center for Biological Research, Russian Academy of Sciences
Author for correspondence.
Email: sergeybut20063@gmail.com
Winogradsky Institute of Microbiology; Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms
Russian Federation, Moscow, 119071; Moscow region, Pushchino, 142290O. N. Rozova
Research Center of Biotechnology, Russian Academy of Sciences; Pushchino Scientific Center for Biological Research, Russian Academy of Sciences
Email: sergeybut20063@gmail.com
Winogradsky Institute of Microbiology; Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms
Russian Federation, Moscow, 119071; Moscow region, Pushchino, 142290S. V. Chistyakova
Pushchino Scientific Center for Biological Research, Russian Academy of Sciences
Email: sergeybut20063@gmail.com
Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms
Russian Federation, Moscow region, Pushchino, 142290D. S. Potapova
Tula State University
Email: sergeybut20063@gmail.com
Russian Federation, Tula, 300012
V. N. Khmelenina
Pushchino Scientific Center for Biological Research, Russian Academy of Sciences
Email: sergeybut20063@gmail.com
Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms
Russian Federation, Moscow region, Pushchino, 142290I. I. Mustakhimov
Research Center of Biotechnology, Russian Academy of Sciences; Pushchino Scientific Center for Biological Research, Russian Academy of Sciences
Email: sergeybut20063@gmail.com
Winogradsky Institute of Microbiology; Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms
Russian Federation, Moscow, 119071; Moscow region, Pushchino, 142290References
- Розова О. Н., Хмеленина В. Н., Мустахимов И. И., Бут С. Ю., Троценко Ю. А. Свойства рекомбинантного малик-фермента у аэробного метанотрофа Methylosinus trichosporium // Биохимия. 2019. T. 84. C. 532–539.
- Rozova O. N., Khmelenina V. N., Mustakhimov I. I., But S. Yu., Trotsenko Yu.A . Properties of malic enzyme from the aerobic methanotroph Methylosinus trichosporium // Biochemistry (Moscow). 2019. V. 84. Р. 390‒397.
- Хмеленина В. Н., Бесчастный А. П., Гаязов А. П., Троценко Ю. А. . Влияние пирофосфата на рост и метаболизм Methylomonas methanica // Микробиология. 1994. Т. 63. С. 188–193.
- B uch A., Archana G., Naresh Kumar G. Heterologous expression of phosphoenolpyruvate carboxylase enhances the phosphate solubilizing ability of fluorescent pseudomonads by altering the glucose catabolism to improve biomass yield // Bioresour Technol. 2010. V. 101. P. 679–687.
- But S. Y., Egorova S. V., Khmelenina V. N., Mustakhimov I. I. Malyl-CoA lyase provides glycine/glyoxylate synthesis in type I methanotroph // FEMS Microbiol. Lett. 2020. V. 367. Art. fnaa207.
- But S. Y., Egorova S. V., Khmelenina V. N., Trotsenko Y. A. Serine-glyoxylate aminotranferases from methanotrophs using different C1-assimilation pathways // Antonie van Leeuwenhoek. 2019. V. 112. P. 741–751.
- Hanson R., Hanson T. Methanotrophic bacteria // Microbiol. Rev. 1996. V. 60. P. 439–471.
- Henard C. A., Smith H., Dowe N., Kalyuzhnaya M. G., Pienkos P. T., Guarnieri M. T. Bioconversion of methane to lactate by an obligate methanotrophic bacterium // Sci. Rep. 2016. V. 6. Art. 21585.
- Koffas M. A.G., Jung G. Y., Stephanopoulos G. Engineering metabolism and product formation in Corynebacterium glutamicum by coordinated gene overexpression // Metab. Eng. 2003. V. 5. P. 32–41.
- Oshkin I. Y., Danilova O. V., But S. Y., Miroshnikov K. K., Suleimanov R. Z., Belova S. E., Tikhonova E. N., Kuznetsov N. N., Khmelenina V. N., Pimenov N. V., Dedysh S. N. Expanding characterized diversity and the pool of complete genome sequences of Methylococcus species, the bacteria of high environmental and biotechnological relevance // Front. Microbiol. 2021. V. 12. Art. 756830.
- Oshkin I. Y., Suleimanov R. Z., Khmelenina V. N., Mardanov A. V., Pimenov N. V. , Dedysh S. N. Complete genome sequence of Methylococcus capsulatus MIR, a methanotroph capable of growth on methanol // Microbiol. Resour. Announc. 2022. V. 11. Art. e0054222.
- Rumah B. L., Claxton Stevens B. H., Yeboah J. E., Stead C. E., Harding E. L., Minton N. P., Zhang Y. In vivo genome editing in type I and II methanotrophs using a CRISPR/Cas9 system // ACS Synth. Biol. 2023. V. 12. P. 544–554.
- Schaefer H., Mikaloff Fletcher S. E., Veidt C., Lassey K. R., Brailsford G. W., Bromley T. M., Dlugokencky E. J., Michel S. E., Miller J. B., Levin I., Lowe D. C., Martin R. J. , Vaughn B. H., White J. W.C. A 21 st -century shift from fossil-fuel to biogenic methane emissions indicated by 13 CH 4 // Science. 2016. V. 352. P. 80–84.
- Strong P. J., Kalyuzhnaya M., Silverman J., Clarke W. P. A methanotroph-based biorefinery: potential scenarios for generating multiple products from a single fermentation // Bioresour. Technol. 2016. V. 215. P. 314–323.
- Tollefson J . Scientists raise alarm over “dangerously fast” growth in atmospheric methane // Nature. 2022. https://doi.org/10.1038/d41586-022-00312-2
Supplementary files
