Отправить статью по E-mail 
Экспрессия гетерологичной ФЕП-карбоксилазы в Methylococcus capsulatus MIR: влияние на ростовые характеристики и аминокислотный состав биомассы метанотрофа
- Авторы: Бут С.Ю.1,2, Розова О.Н.1,2, Чистякова С.В.2, Потапова Д.С.3, Хмеленина В.Н.2, Мустахимов И.И.1,2
-
Учреждения:
- ФИЦ Биотехнологии РАН
- ФИЦ “Пущинский научный центр биологических исследований РАН”
- Тульский государственный университет
- Выпуск: Том 93, № 6 (2024)
- Страницы: 879-883
- Раздел: КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
- URL: https://journal-vniispk.ru/0026-3656/article/view/276185
- DOI: https://doi.org/10.31857/S0026365624060173
- ID: 276185
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Methylococcus capsulatus MIR – штамм метанотрофных бактерий, потенциально пригодный для использования в биотехнологии получения кормового белка и других продуктов с добавленной стоимостью из метана. Геномный анализ не выявил у Mc. capsulatus MIR известных путей С3-карбоксилирования, необходимых для восполнения интермедиатов цикла трикарбоновых кислот и полноценного функционирования метаболизма. Ген pepc, кодирующий ФЕП-карбоксилазу у Methylomonas rapida 12, вносили в клетки Mc. capsulatus MIR на плазмиде под контролем промотора средней силы. Экспрессия гетерологичной ФЕП-карбоксилазы в клетках рекомбинантного штамма привела к повышению содержания глутамата, глицина и лизина, однако не привела к увеличению скорости роста культуры. Таким образом, внесение гетерологичной ФЕП-карбоксилазы, осуществляющей реакцию С3-карбоксилирования, способствует повышению пищевой ценности биомассы метанотрофа.
Ключевые слова
Полный текст
Метан является вторым по распространенности после диоксида углерода парниковым газом. При этом концентрация метана в атмосфере в последнее время выросла до угрожающих значений, что вносит значительный вклад в глобальное потепление (Schaefer et al., 2016; Tollefson, 2022). Одним из основных источников метана является попутный газ, выделяемый при добыче нефти, который в настоящее время большей частью не используется, а просто сжигается. Аэробные метанотрофы – специализированная группа бактерий, использующих метан и метанол в качестве источников углерода и энергии (Hanson, Hanson, 1996). Благодаря способности синтезировать из метана все клеточные компоненты, метанотрофы рассматриваются в качестве биокатализаторов при получении широкого спектра органических соединений (Henard et al., 2016; Strong et al., 2016). Термотолерантный метанотроф Methylococcus capsulatus MIR, выделенный из ила городских очистных сооружений Иркутска, обладает высокой скоростью роста при 42°С и перспективен в качестве продуцента кормового белка (Oshkin et al., 2022).
Анализ доступных геномов метанотрофов рода Methylococcus не выявил гены, кодирующие известные ферменты С3-карбоксилирования (Oshkin et al., 2021). Вместе с тем данные анаплеоротические реакции важны в метаболизме бактерий, поскольку восполняют пул соединений, образующихся в цикле трикарбоновых кислот (ЦТК) и расходующихся на синтез аминокислот и вторичных метаболитов. Метанотрофы I типа используют рибулозомонофосфатный цикл в качестве основного пути ассимиляции С1-соединений. Кроме того, у этих бактерий присутствуют гены серинового пути, который, однако, считается неполным из-за отсутствия генов фосфоенолпируват (ФЕП) карбоксилазы ‒ одного из ключевых ферментов серинового пути (But et al., 2019). Единственным исключением из этой закономерности являются метанотрофы рода Methylomonas, поскольку в их геномах имеется полный набор генов серинового цикла. У других метанотрофов I типа, в частности, у Methylotuvimicrobium alcaliphilum 20Z, имеются пируваткарбоксилаза и ФЕП-карбоксикиназа, по-видимому, выполняющие функцию восполнения оксалоацетата – предшественника аминокислот аспартатной группы. Ранее было обнаружено, что сверхэкспрессия С3 карбоксилаз может улучшать ростовые характеристики гетеротрофных бактерий за счет увеличения потока углерода в ЦТК (Koffas et al., 2003; Buch et al., 2010). Аналогичный эффект можно ожидать для метанотрофов.
Целью данной работы являлось изучение влияния экспрессии гетерологичной ФЕП-карбоксилазы из Methylomonas rapida 12 на ростовые характеристики и накопление аминокислот у термотолерантного метанотрофа M c. capsulatus MIR.
Mc. capsulatus MIR выращивали на среде П (Хмеленина и соавт., 1994) в атмосфере метана и воздуха при 42°С. Для сверхэкспрессии ФЕП-карбоксилазы была создана плазмида, в которой ген pepc из Methylomonas rapida 12 находился под контролем промотора PphaC из Cupriavidus necator H16. Ранее PphaC зарекомендовал себя как промотор средней силы при использовании в клетках Mc. capsulatus (Rumah et al., 2023). Полученную плазмиду pAWP-pepc вводили в клетки Mc. capsulatus MIR с помощью конъюгации со штаммом E. coli S-17-1. Трансконъюганты отбирали на среде П, содержащей 25 мкг/мл канамицина. Для получения рекомбинантной ФЕП-карбоксилазы ген pepc клонировали в экспрессионном векторе pET28b(+), полученной плазмидой трансформировали штамм E. coli Rosetta (DE3). Клетки, несущие плазмиду, выращивали на среде LB до ОП600 ~ 0.6, индукцию экспрессии осуществляли с помощью добавления изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ) до концентрации 0.5 мМ и инкубацией в течение ночи при 18°С. Рекомбинантный фермент очищали на колонке с Ni-NTA-агарозой (“Quiagen”, Германия), элюируя градиентом имидазола. Активность ФЕП-карбоксилазы измеряли спектрофотометрически при 340 нм в реакционной смеси, содержавшей 50 мМ MOPS-KOH (рН 9.0), 5 мМ MgCl2, 5 мМ KHCO3, 3 мМ НАДН, 5 Е малатдегидрогеназы из Methylosinus trichosporium OB3b (Розова и соавт., 2019). Для измерения содержания аминокислот Mc. capsulatus MIR/pAWP-pepc выращивали в качалочных колбах с 200 мл среды П, содержавшей 25 мкг/мл канамицина. Колбы заполняли смесью метан‒воздух (1 : 1), культивировали при 42°С в течение 2 сут. В качестве контроля использовали клетки, несущие плазмиду pAWP-PphaC без гена pepc. Биомассу собирали, лиофилизировали, метаболиты экстрагировали 80%-м хлороформом. Экстракты упаривали досуха, растворяли в воде, несколько раз экстрагировали метанолом, водную фракцию использовали для анализа аминокислот. Анализ проводили на колонке Reprosil OPA (“Dr. Maisch”, Германия), как описано ранее (But et al., 2020).
Функциональность ФЕП-карбоксилазы из Methylomonas methanica 1 2 была доказана с помощью гетерологичной экспрессии в E. coli. Фермент катализировал карбоксилирование ФЕП до оксалоацетата в присутствии бикарбонат-ионов. Максимальную активность рекомбинантная ФЕП-карбоксилаза проявляла при 45°С и рН 9.0. Активность фермента в 2.5 раза стимулировалась внесением в реакционную смесь пирувата. Фермент подчинялся кинетике Хилла. В присутствии 1 мМ пирувата активность фермента (Vmax) составила 22.2 ± 0.6 Е/мг белка, а значение S0.5 для ФЕП – 0.26 ± 0.02 мМ. Пируват является одним из центральных метаболитов у метанотрофов I типа. Повышение активности и аффинности к субстрату ФЕП-карбоксилазы из Mm. methanica 12 в присутствии пирувата делают данный фермент удачным выбором для создания синтетического анаплеротического пути у Mc. capsulatus MIR.
Гетерологичная экспрессия ФЕП-карбоксилазы в Mc. capsulatus MIR не привела к увеличению скорости роста по сравнению с контрольным штаммом, несущим пустой вектор (рис. 1), при этом штамм, несущий ген pepc, накапливал меньше биомассы. Анализ свободных аминокислот выявил повышение уровня глутамата, глицина и лизина (рис. 2).
Рис. 1. Кривые роста штаммов MIR/pAWP-Pphac (1) и MIR/pAWP-pepc (2).
Рис. 2. Накопление аминокислот клетками штаммов MIR/pAWP-Pphac (1) и MIR/pAWP-pepc (2). Бары представляют стандартное отклонение для трех независимых экспериментов. Для определения статистической значимости различий использовали тест Стьюдента; *p < 0.05.
Данный результат является логичным, поскольку лизин и глутамат синтезируются из интермедиатов ЦТК – оксалоацетата (через аспартат) и 2-оксоглутарата соответственно. Примечательно, что при этом содержание аспартата в клетках модифицированного штамма не изменилось, что, возможно, связано с оттоком аминокислоты на биосинтез. Особый интерес представляет увеличение содержания лизина. Поскольку данная аминокислота является незаменимой, биомасса, обогащенная лизином, имеет повышенную ценность с биотехнологической точки зрения. Экспрессия ФЕП-карбоксилазы не повлияла на скорость роста, что можно объяснить тем фактом, что, в отличие от гетеротрофных бактерий (Koffas et al., 2003; Buch et al., 2010), ЦТК у метанотрофов не является основным источником энергии, а значительная часть восстановительных эквивалентов образуется при последовательном окислении метана до СО2.
ФИНАНСИРОВАНИЕ
Работа выполнена в рамках проекта “Развитие технологий геномного редактирования для решения инновационных задач промышленных и пищевых биотехнологий” № 075-15-2021-1071, финансируемого Министерством науки и высшего образования РФ.
СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ
Настоящая статья не содержит результатов исследований с использованием животных в качестве объектов.
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Об авторах
С. Ю. Бут
ФИЦ Биотехнологии РАН; ФИЦ “Пущинский научный центр биологических исследований РАН”
Автор, ответственный за переписку.
Email: sergeybut20063@gmail.com
Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского; ИБФМ РАН
Россия, Москва, 119071; Московская обл., Пущино, 142290О. Н. Розова
ФИЦ Биотехнологии РАН; ФИЦ “Пущинский научный центр биологических исследований РАН”
Email: sergeybut20063@gmail.com
Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского; ИБФМ РАН
Россия, Москва, 119071; Московская обл., Пущино, 142290С. В. Чистякова
ФИЦ “Пущинский научный центр биологических исследований РАН”
Email: sergeybut20063@gmail.com
ИБФМ РАН
Россия, Московская обл., Пущино, 142290Д. С. Потапова
Тульский государственный университет
Email: sergeybut20063@gmail.com
Россия, Тула, 300012
В. Н. Хмеленина
ФИЦ “Пущинский научный центр биологических исследований РАН”
Email: sergeybut20063@gmail.com
ИБФМ РАН
Россия, Московская обл., Пущино, 142290И. И. Мустахимов
ФИЦ Биотехнологии РАН; ФИЦ “Пущинский научный центр биологических исследований РАН”
Email: sergeybut20063@gmail.com
Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского; ИБФМ РАН
Россия, Москва, 119071; Московская обл., Пущино, 142290Список литературы
- Розова О. Н., Хмеленина В. Н., Мустахимов И. И., Бут С. Ю., Троценко Ю. А. Свойства рекомбинантного малик-фермента у аэробного метанотрофа Methylosinus trichosporium // Биохимия. 2019. T. 84. C. 532–539.
- Rozova O. N., Khmelenina V. N., Mustakhimov I. I., But S. Yu., Trotsenko Yu.A . Properties of malic enzyme from the aerobic methanotroph Methylosinus trichosporium // Biochemistry (Moscow). 2019. V. 84. Р. 390‒397.
- Хмеленина В. Н., Бесчастный А. П., Гаязов А. П., Троценко Ю. А. . Влияние пирофосфата на рост и метаболизм Methylomonas methanica // Микробиология. 1994. Т. 63. С. 188–193.
- B uch A., Archana G., Naresh Kumar G. Heterologous expression of phosphoenolpyruvate carboxylase enhances the phosphate solubilizing ability of fluorescent pseudomonads by altering the glucose catabolism to improve biomass yield // Bioresour Technol. 2010. V. 101. P. 679–687.
- But S. Y., Egorova S. V., Khmelenina V. N., Mustakhimov I. I. Malyl-CoA lyase provides glycine/glyoxylate synthesis in type I methanotroph // FEMS Microbiol. Lett. 2020. V. 367. Art. fnaa207.
- But S. Y., Egorova S. V., Khmelenina V. N., Trotsenko Y. A. Serine-glyoxylate aminotranferases from methanotrophs using different C1-assimilation pathways // Antonie van Leeuwenhoek. 2019. V. 112. P. 741–751.
- Hanson R., Hanson T. Methanotrophic bacteria // Microbiol. Rev. 1996. V. 60. P. 439–471.
- Henard C. A., Smith H., Dowe N., Kalyuzhnaya M. G., Pienkos P. T., Guarnieri M. T. Bioconversion of methane to lactate by an obligate methanotrophic bacterium // Sci. Rep. 2016. V. 6. Art. 21585.
- Koffas M. A.G., Jung G. Y., Stephanopoulos G. Engineering metabolism and product formation in Corynebacterium glutamicum by coordinated gene overexpression // Metab. Eng. 2003. V. 5. P. 32–41.
- Oshkin I. Y., Danilova O. V., But S. Y., Miroshnikov K. K., Suleimanov R. Z., Belova S. E., Tikhonova E. N., Kuznetsov N. N., Khmelenina V. N., Pimenov N. V., Dedysh S. N. Expanding characterized diversity and the pool of complete genome sequences of Methylococcus species, the bacteria of high environmental and biotechnological relevance // Front. Microbiol. 2021. V. 12. Art. 756830.
- Oshkin I. Y., Suleimanov R. Z., Khmelenina V. N., Mardanov A. V., Pimenov N. V. , Dedysh S. N. Complete genome sequence of Methylococcus capsulatus MIR, a methanotroph capable of growth on methanol // Microbiol. Resour. Announc. 2022. V. 11. Art. e0054222.
- Rumah B. L., Claxton Stevens B. H., Yeboah J. E., Stead C. E., Harding E. L., Minton N. P., Zhang Y. In vivo genome editing in type I and II methanotrophs using a CRISPR/Cas9 system // ACS Synth. Biol. 2023. V. 12. P. 544–554.
- Schaefer H., Mikaloff Fletcher S. E., Veidt C., Lassey K. R., Brailsford G. W., Bromley T. M., Dlugokencky E. J., Michel S. E., Miller J. B., Levin I., Lowe D. C., Martin R. J. , Vaughn B. H., White J. W.C. A 21 st -century shift from fossil-fuel to biogenic methane emissions indicated by 13 CH 4 // Science. 2016. V. 352. P. 80–84.
- Strong P. J., Kalyuzhnaya M., Silverman J., Clarke W. P. A methanotroph-based biorefinery: potential scenarios for generating multiple products from a single fermentation // Bioresour. Technol. 2016. V. 215. P. 314–323.
- Tollefson J . Scientists raise alarm over “dangerously fast” growth in atmospheric methane // Nature. 2022. https://doi.org/10.1038/d41586-022-00312-2
Дополнительные файлы
