The Influence of Peptide Linkers on Functional Properties of Hybrid Structures with the Selective pH-Dependent Binding to Cancer Cells

Full Text

Влияние пептидных линкеров на функциональные свойства гибридных структур c избирательным рh-зависимым связыванием с раковыми клетками¹

Сокращения: ФБ – флуоресцентный белок; EGFP – улучшенный вариант зеленого флуоресцентного белка из Aequorea victoria; pHLIP – пептидный фрагмент бактериородопсина, проявляющий рН-зависимое связывание с мембранными структурами (pH Low Insertion Peptide); pHLIPwt – природный пептид pHLIP; pHLIPvar3 – мутантный укороченный вариант pHLIP.

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время при лечении онкологических заболеваний применяются методы лучевой, радиоизотопной, гормональной, иммуно- и химиотерапии. Специфичность этих методов оставляет желать лучшего, и в большинстве случаев их применение оказывает вредное побочное воздействие на весь организм человека. В связи с этим в современной прецизионной медицине делается акцент на препараты, обладающие нацеленным действием на пораженные ткани, в частности предпринимаются попытки создания таких адресных препаратов на основе антител и других лигандов к определенным антигенам или рецепторам, гиперэкспрессирующимся на поверхности некоторых раковых клеток. Однако нестабильная экспрессия этих маркеров существенно затрудняет применение данного метода. Также при использовании этих средств часто возникает резистентность за счет клональной селекции, которая затрудняет терапию. Кроме того, обычные клетки экспрессируют те же онкомаркерные белки, что приводит к побочным эффектам при терапии с помощью антител и других адресных лигандов.

Другой, более универсальный подход основан на различиях в физико-химических свойствах нормальных и опухолевых клеток. Известно, что процесс опухолеобразования может сопровождаться понижением рН во внеклеточном пространстве (рН 6.0–6.7). Недавние исследования [1, 2], в том числе проведенные в нашей лаборатории [3], показали, что один из трансмембранных пептидных фрагментов белка бактериородопсина (pHLIP) демонстрирует рН-зависимое связывание с плазматической мембраной клетки. При значениях рН 7.2–7.4 он преимущественно находится в водной фазе, однако при рН ˂ 7.0 наблюдается встраивание пептида в мембрану. При этом показано, что pHLIP обладает способностью переносить различные низкомолекулярные соединения (˂ 7 кДа) через мембрану живой клетки в цитоплазму [2]. Для получения таких конструкций обычно используется твердофазный синтез пептида, затем низкомолекулярные соединения конъюгируют с pHLIP химическими методами [4]. Однако способность pHLIP доставлять более высокомолекулярные соединения, в том числе белки, к настоящему времени изучена не столь подробно [5–8].

Ранее нами были получены модельные конструкции в виде конъюгатов пептида pHLIP с белками [3]. Они представляли собой гибридные структуры на основе флуоресцентного белка (ФБ) EGFP и линкерной последовательности, соединяющей ФБ с двумя различными вариантами пептида: с пептидом дикого типа (pHLIPwt) и его укороченным мутантным вариантом Var3 (pHLIPvar3) [9]. Нами было продемонстрировано эффективное рН-зависимое связывание этих конструкций c клетками.

В настоящей работе получены конструкции, несущие те же функциональные части, но другую линкерную последовательность между доменами, и продемонстрировано влияние различных линкеров на функциональные свойства этих конструкций, в том числе на рН-зависимое связывание с раковыми клетками и на эффективность синтеза хромофора ФБ в составе белково-пептидной конструкции.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Дизайн и наработка конструкций EGFP/ pHLIP. Для более подробного изучения возможности применения pHLIP-технологии для доставки к раковым клеткам высокомолекулярных соединений были получены гибридные конструкции, состоящие из пептидов pHLIP и белкового компонента. Последний был представлен флуоресцентным белком EGFP, выполняющим роль как модельного груза, переносимого при помощи pHLIP, так и флуоресцентной метки, обладающей высокой яркостью (рис. 1).

 

Рис. 1. Упрощенная схема (а) и пространственная модель (б) гибридных конструкций. Гексагистидиновая метка обозначена синим цветом, флуоресцентный белок – зеленым, линкер (linker) – лиловым, pHLIP – оранжевым.

 

В качестве рНчувствительной составляющей были выбраны два варианта пептида: природный pHLIPwt и его укороченный мутантный вариант pHLIPvar3. В предыдущей работе [3] конструкции содержали короткий пептидный линкер –GS–, соединяющий белковую часть в виде EGFP с пептидом pHLIP. В настоящей работе в качестве линкера мы использовали удлиненную последовательность аминокислот –IEGRCGS–, которая, с одной стороны, содержит заряженные группы, способствующие большей растворимости в водной среде, а с другой стороны, за счет скомпенсированности в целом заряжены нейтрально. Согласно литературным данным, встраивание рН-чувствительных пептидов происходит с транслокацией их С-конца через мембрану клетки [1], поэтому все гибридные конструкции содержали гексагистидиновую метку на своем N-конце. Наработку полученных конструкций и контрольного EGFP проводили одновременно в бактериальных клетках Escherichia coli штамма BL21 (DE3). Выделение белково-пептидных конструкций выполняли при помощи металл-хелатной хроматографии на Ni-NTA-агарозе. Их чистоту и целостность подтверждали при помощи SDS-электрофореза в 12%-ном ПААГ (рис. S2 в дополнительных материалах).

Эффективность созревания хромофора флуоресцентного белка в конструкциях EGFP/pHLIP. Известно, что синтез хромофора ФБ происходит автокаталитически в присутствии кислорода в качестве окислителя. Один из ключевых факторов эффективности автокатализа – правильная упаковка белка [10]. В этом ключе ФБ – хороший модельный объект для демонстрации возможного влияния pHLIP и линкеров на функциональную активность белка в составе гибридной конструкции.

Мы изучили влияние пептидов pHLIP на синтез хромофора EGFP в составе гибридных структур. Для этого регистрировали спектры поглощения каждой конструкции (рис. 2) и определяли общую концентрацию белково-пептидных конструкций при 280 нм и концентрации конструкций с полностью созревшим хромофором по поглощению при 488 нм. Степень созревания хромофора определяли отношением значений концентрации конструкций с полностью созревшим хромофором к общей концентрации. В контрольном белке EGFP степень созревания хромофора составила ~77% (табл. 1). В случае белково-пептидных конструкций, содержащих GS-линкер, хромофор синтезировался примерно на 20% хуже относительно контроля, а в конструкциях с линкером IEGRCGS – примерно на 30%.

 

Таблица 1. Свойства конструкций EGFP/pHLIP и EGFP

№	Конструкция	ɛ280, М⁻¹ см⁻¹	Степень созревания хромофора, %	Степень созревания хромофора относительно EGFP, %	Молекулярный вес, Да
1	EGFP-IEGRCGS-pHLIPwt	34 380	55	71	32 122
2	EGFP-IEGRCGS-pHLIPvar3	32 890	55	71	31 232
3	EGFP-GS-pHLIPwt	34 380	64	83	31 564
4	EGFP-GS-pHLIPvar3	32 890	63	81	30 674
5	EGFP (контроль)	20 400	77	100	27 429

 

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что пептид pHLIP в составе пептидно-белковых конструкций может влиять на эффективность синтеза хромофора ФБ, причем степень влияния зависит и от природы линкера. Нарушение процесса синтеза хромофора ФБ может быть вызвано как нарушением упаковки белка, так и аллостерическими эффектами.

рН-зависимое связывание конструкций EGFP/pHLIP с клетками HeLa согласно данным проточной цитофлуориметрии. Для анализа связывания полученных гибридных конструкций с раковыми клетками HeLa при понижении рН использовали метод проточной цитофлуориметрии. Был протестирован диапазон значений рН 5.6–7.4 с шагом 0.2 единицы. В качестве контроля неспецифического связывания использовали свободный EGFP.

 

Рис. 2. Нормализованные спектры поглощения конструкций EGFP/pHLIP и EGFP.

 

При нейтральных значениях pH клетки, обработанные EGFP-IEGRCGS-pHLIPwt и EGFP-GS-pHLIPwt, обладали низким значением флуоресцентного сигнала, сопоставимым с контрольными клетками, обработанными EGFP. Однако при рН < 6.8 наблюдалось многократное увеличение флуоресцентного сигнала клеток с рК_а ~ 6.4 (рис. 3, табл. 2), при этом связывание конструкции, содержащей линкер IEGRCGS, было в несколько раз эффективнее. Аналогичный результат наблюдался при сравнительном тестировании конструкций EGFP-IEGRCGS-pHLIPvar3 и EGFP-GS-pHLIPvar3. В конструкциях, содержащих IEGRCGS-линкер, интенсивность флуоресцентного сигнала клеток оказалась выше. Это свидетельствует об однозначном увеличении эффективности связывания при замене GS-линкера на IEGRCGS в гибридных конструкциях (табл. 2).

 

Таблица 2. Эффективность рН-зависимого связывания белково-пептидных конструкций с клетками HeLa

№	Конструкция	рКа	Относительное количество белка, связавшегося с клетками*
1	EGFP-IEGRCGS-pHLIPwt	6.30 ± 0.01	1
2	EGFP-GS-pHLIPwt	6.36 ± 0.03	0.35
3	EGFP-IEGRCGS-pHLIPvar3	6.22 ± 0.33, 5.85 ± 0.03	0.46
4	EGFP-GS-pHLIPvar3	6.46 ± 0.02	0.035

* Количество белка, связавшегося с клетками, оценивали по значению F_a – кислотной базовой линии (см. раздел “Эксперим. часть”) относительно EGFP-IEGFCGS-pHLIPwt.

 

Стоит также отметить, что рН-зависимое связывание EGFP-IEGRCGS-pHLIPvar3 с раковыми клетками характеризовалось двумя рК_а (наблюдалось два перегиба, табл. 2), при этом основное связывание происходит с рК_а ~ 5.9. Это свидетельствует о возникновении дополнительных рН-зависимых перестроек в этой конструкции, которые стали возможны при введении последовательности IEGRC в линкер. Однако несмотря на то, что эффективность связывания конструкции с pHLIPvar3 выросла, она все же остается ниже, чем у EGFP-IEGRCGS-pHLIPwt.

 

Рис. 3. рН-зависимое связывание с клетками HeLa конструкций EGFP/pHLIPwt и EGFP/pHLIPvar3 с линкерами GS и IEGRCGS при различных значениях рН. Значения медиан интенсивности флуоресценции (MFI) нормированы относительно EGFP-IEGFCGS-pHLIPwt (наиболее эффективно связывающейся конструкции) с поправкой на степень созревания хромофора.

 

Ранее сообщалось, что при доставке низкомолекулярных красителей pHLIPvar3 обладал улучшенными по сравнению с pHLIPwt показателями накопления в опухолях [9]. Однако при тестировании этих пептидов в виде конъюгатов с белковым компонентом in vitro наблюдалась обратная ситуация: конструкции с pHLIPwt демонстрировали более эффективное связывание при понижении рН в сравнении с pHLIPvar3 при использовании одного и того же линкера [3]. Полученные в этой работе данные также подтверждают эту закономерность.

рН-зависимое связывание конструкций EGFP/pHLIPwt с клетками HeLa по данным флуоресцентной микроскопии. При помощи конфокальной флуоресцентной микроскопии были протестированы конструкции, которые продемонстрировали наиболее эффективное pH-зависимое связывание и оптимальные рК_а в цитофлуориметрическом исследовании – EGFP-IEGRCGS-pHLIPwt и EGFP-GS-pHLIPwt. Эти конструкции инкубировали с клетками HeLa при рН 6.2 и 7.4, проводили отмывку при помощи PBS, фиксировали клетки 4%-ным раствором формалина и окрашивали ядра меткой Hoechst 33342.

Согласно полученным данным, обе конструкции связывались с мембранами клеток при рН 6.2, однако уровень зеленого флуоресцентного сигнала был выше в случае обработки клеток EGFP-IEGRCGS-pHLIPwt (рис. 4).

 

Рис. 4. pH-зависимое связывание EGFP/pHLIPwt с клетками HeLa, определенное с помощью конфокальной микроскопии. Слева направо: изображения в зеленом (EGFP, возбуждение 488 нм, излучение 500–550 нм) и синем (Hoechst 33258, возбуждение 405 нм, излучение 420–470 нм) каналах флуоресценции, проходящем свете и их наложение. Масштабный отрезок 20 мкм.

 

При рН 7.4 ни одна из рекомбинантных конструкций не связывалась с мембранами клеток. На контрольных клетках, обработанных EGFP аналогичным образом при рН 6.2 и 7.4, в обоих случаях не наблюдалось связывания (рис. S3 в дополнительных материалах). Эти результаты подтверждают данные по рН-зависимому связыванию конструкций, полученные методом проточной цитофлуориметрии.

Следует отдельно отметить, что согласно литературным данным, все полученные ранее конструкции pHLIP с низкомолекулярными соединениями, липосомами и с наночастицами обладали также побочным неспецифическим связыванием с мембранами клеток при физиологических значениях рН [9, 10]. Однако полученные нами гибридные белково-пептидные конструкции как в данной работе, так и в более ранних исследованиях [3, 8] демонстрировали селективное рН-зависимое связывание и практически полное отсутствие взаимодействия с мембраной клеток при нейтральных значениях рН. По-видимому, это обусловлено присутствием гидрофильного ФБ, который обеспечивает высокую водорастворимость полученных конструкций.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Дизайн и синтез рекомбинантных гибридных конструкций EGFP-pHLIP. Были получены гены, кодирующие последовательность зеленого флуоресцентного белка (EGFP) и пептидов pHLIP в одной рамке считывания. Для этого использовали полимеразную цепную реакцию с геном EGFP в качестве матрицы и серией прямых и обратных праймеров, кодирующих дополнительные последовательности на 3'-концах. кДНК клонировали по сайтам BamHI и HindIII модифицированного вектора экспрессии pET-24a, несущего между сайтами NdeI и BamHI гексагистидиновую последовательность. Последовательности кДНК для всех полученных генов были проверены путем секвенирования. Полные нуклеотидные и аминокислотные последовательности гибридных конструкций EGFP-IEGRCGS-pHLIPwt и EGFP-IEGRCGS-pHLIPvar3 представлены на рис. S1 в дополнительных материалах.

Наработка белков в E. coli и их выделение. Для получения гибридных белково-пептидных конструкций в достаточных количествах клетки E. coli BL21(DE3) трансформировали плазмидой pET-24, содержащей интересующий ген, и выращивали в жидкой питательной среде LB с добавлением канамицина (25 мг/мл) при 37°С при перемешивании со скоростью 250 об/мин до достижения оптической плотности 0.6–0.8 при 600 нм. После этого добавляли IPTG (0.4 мМ) и выращивали клетки в течение 4 ч при 37°С, а затем дополнительно инкубировали в течение ночи при 18°С. Затем суспензию клеток осаждали центрифугированием при 3000 g в течение 15 мин при 4°С. Полученные осадки хранили при –20°С. Для выделения целевых конструкций клетки размораживали, ресуспендировали в промывочном буфере (50 мМ Tris-HCl, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазола, рН 8.0) и затем разрушали при помощи ультразвукового дезинтегратора Sonopulse HD 3100 (Bandeline, Германия). Клеточный лизат осаждали центрифугированием при 20 000 g в течение 30 мин при 4°С. После этого супернатант наносили на колонку с Ni-NTA-агарозой (Qiagen, Нидерланды), предварительно уравновешенной промывочным буфером. После нанесения колонку промывали 5-кратным объемом промывочного буфера и элюировали буфером, содержащим 50 мМ Tris-HCl, 300 мМ NaCl, 250 мМ имидазола, pH 8.0. Выделенные конструкции переводили в PBS с использованием гель-фильтрационных колонок Micro Bio-Spin™ 6 (Bio-Rad Laboratories, Inc., США), заполненных Bio-Gel P-6 (Bio-Rad Laboratories, Inc., США). Чистоту и целостность гибридных конструкций подтверждали при помощи SDS-электрофореза в 12%-ном ПААГ, выполненного по стандартному протоколу.

Определение концентрации гибридных конструкций при помощи спектрофотометрии. Спектры поглощения измеряли на спектрофотометре Cary 50 Bio (Varian, США). Общие концентрации гибридных конструкций определяли по поглощению при 280 нм, а концентрации конструкций со зрелым хромофором – при 488 нм. Расчеты коэффициентов экстинкции при 280 нм (табл. 1) проводили на основе аминокислотной последовательности при помощи программного обеспечения SnapGene (GSL Biotech LLC, США). Коэффициент экстинкции EGFP со зрелым хромофором при 488 нм принимали равным 55 000 М⁻¹см⁻¹[11].

Культивирование клеток. Клетки карциномы шейки матки человека HeLa выращивали в среде DMEM (Thermo Fisher Scientific Inc., США) с добавлением фетальной бычьей сыворотки (FBS, Thermo Fisher Scientific Inc., США) до 10%, L-глутамина до 2 мМ (ПанЭко, Россия), 100 ед./мл пенициллина и 0.1 мг/мл стрептомицина (Thermo Fisher Scientific Inc., США). Клетки культивировали во влажной атмосфере при 37°C и 5% CO₂. Среду обновляли каждые 2–3 дня.

Проточная цитофлуориметрия. Клетки HeLa выращивали в культуральных флаконах Т-25 до конфлюэнтности ~90% (~2 млн клеток на флакон). Затем среду удаляли, добавляли 1 мл раствора Версена и инкубировали клетки при 37°С во влажной атмосфере с 5% CO₂. После 10 мин инкубации клетки ресуспендировали до получения гомогенной суспензии и центрифугировали 3 мин при 125 g. Супернатант удаляли, клетки ресуспендировали в 600 мкл PBS с добавлением FBS до 10%. Образцы для исследования готовили при помощи смешивания 3 мкл полученной клеточной суспензии с 97 мкл буферного раствора желаемого pH (диапазон значений рН 5.6–7.4 с шагом 0.2 единицы), содержащего 50 мМ фосфата, 100 мМ NaCl, 10% FBS и гибридный или контрольный белок в концентрации 1 мкМ. Полученную смесь инкубировали 15 мин при 37°С, затем клетки осаждали центрифугированием 30 с при 1000 g, супернатант удаляли, добавляли 100 мл PBS и проводили анализ методом проточной цитофлуориметрии с использованием Novocyte 3000 VYB (ACEA Biosciences, США). Обработку полученных данных проводили при помощи программного обеспечения NovoExpress 1.3 (ACEA Biosciences Inc., США). Количество клеток было подобрано так, что после тестирования образца получалось ~20 000 событий. Сначала отбирали события по параметрам FSC-A/SSC-A, а затем по FSC-A/FSC-H, получали гистограммы интенсивности флуоресценции клеток. Для регистрации флуоресценции использовали канал BL1 (лазер возбуждения 488 нм, эмиссионный фильтр 530/30 нм). Для оценки эффективности связывания гибридных белково-пептидных конструкций с клетками использовали отношение значения медианы интенсивности флуоресценции (MFI) к эффективности созревания хромофора EGFP. Для каждой белково-пептидной конструкции анализ проводили в трех повторах. Полученные зависимости MFI от pH аппроксимировали с помощью программы Origin 2021 (OriginLab, США) функцией

$\left(F_b+F_a\times {10}^{m\left(pKa-pH\right)}\right)/\left(1+{10}^{m\left(pKa-pH\right)}\right)$                                                    (1)

или

$F_b+\left(F_a-F_b\right)\left[p/\left(1+{10}^{m1\left(pKa1-pH\right)}\right)+\left(1-p\right)/\left(1+{10}^{m2\left(pKa2-pH\right)}\right)\right]$,               (2)

где F_a – кислотная базовая линия, F_b – щелочная базовая линия, p – вклад компоненты с бо́льшим влиянием, m – наклон перехода, pK_a – середина кривой.

Флуоресцентная микроскопия. Клетки HeLa высевали в 96-луночный планшет в количестве 10⁴ клеток на лунку в 100 мкл культуральной среды и выращивали в течение ночи. Затем среду удаляли и добавляли EGFP/pHLIPwt или EGFP в концентрации 2 мкМ в 100 мкл фосфатного буфера с pH 6.2 или 7.4 (50 мМ фосфата, 100 мМ NaCl и 10% FBS). Клетки инкубировали при 37°С в течение 15 мин, дважды промывали PBS, фиксировали 4%-ным раствором формальдегида в PBS в течение 10 мин. Затем клетки снова промывали PBS и перед микроскопией добавляли флуоресцентную метку Hoechst 33258 (Lumiprobe, Россия) до концентрации 20 нМ для окрашивания ядер. Визуализацию осуществляли при помощи конфокальной системы Zeiss LSM 980 (ZEISS Microscopy, Германия) с использованием объектива 10×. Все изображения были получены при одинаковых условиях съемки и обработки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На примере белково-пептидных конструкций, состоящих из EGFP и двух вариантов pH-чувствительного пептида (pHLIPwt и pHLIPvar3), было показано влияние линкерной последовательности на функциональные свойства этих конструкций. Полученные конструкции содержали два вида линкеров: IEGRCGS (EGFP-IEGRCGS-pHLIPwt и EGFP-IEGRCGS-pHLIPvar3) и GS (EGFP-GS-pHLIPwt и EGFP-GS-pHLIPvar3), который был использован в нашей предыдущей работе [3]. Было установлено, что конструкции с линкером IEGRCGS более эффективно рН-зависимо связываются с клетками HeLa. Также было показано, что слияние EGFP с пептидами pHLIP в некоторой мере влияет на созревание хромофора этого ФБ. Кроме того, было продемонстрировано, что белково-пептидные конструкции, несущие pHLIPwt, более эффективно связываются с мембранами клеток при понижении рН, по сравнению с аналогичными конструкциями с pHLIPvar3.

Таким образом, в данной работе показано, что получение рН-чувствительных конструкций на основе белков и пептидов pHLIP с сохранением их первоначальных функциональных свойств – нетривиальная задача, поскольку на эффективность рН-зависимого связывания может влиять тип используемого линкера. Кроме того, в результате получения таких белково-пептидных конструкций могут нарушаться функциональные свойства белковой компоненты, о чем свидетельствует изменение эффективности синтеза хромофора ФБ.

ФОНДОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Исследование выполнено при поддержке Российского научного фонда (проект № 23-25-00036).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей и использованием животных в качестве объектов исследования.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

 

¹ Дополнительная информация для этой статьи доступна по doi 10.31857/S0132342324040113 для авторизованных пользователей.

About the authors

A. Yu. Frolova

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: anastasiya_frolova_box@mail.ru
Russian Federation, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997

A. A. Pakhomov

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: anastasiya_frolova_box@mail.ru
Russian Federation, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997

S. M. Deyev

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: anastasiya_frolova_box@mail.ru
Russian Federation, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997

V. I. Martynov

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: anastasiya_frolova_box@mail.ru
Russian Federation, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997

References

Supplementary files