Биоорганическая химия

Разработка лекарственных средств, структура которых напоминает структуру естественных компонентов живого организма или полностью им идентична, на сегодняшний день представляет собой перспективное направление, вызывающее огромный интерес среди ученых. Получение синтетических аналогов нуклеиновых кислот стало возможным благодаря активному развитию олигонуклеотидного синтеза в 1980-х гг. и последующим разработкам в области химической модификации нуклеотидов, что предоставило возможность изменять свойства нуклеиновых кислот и повышать их стабильность. Накопленный мировой опыт способствовал разработке лекарственных препаратов на основе синтетических олигонуклеотидов. Начиная с 1998 г., относительно небольшое число препаратов получило одобрение регулирующих органов разных стран на применение в клинической практике, большинство из них направлено на лечение редких (орфанных) заболеваний. На сегодняшний день разрешены к применению 20 терапевтических препаратов на основе синтетических олигонуклеотидов, из которых один препарат – МИР 19^® – разработан в России. В данном обзоре описаны все одобренные (по состоянию на 2024 г.) терапевтические препараты на основе синтетических олигонуклеотидов, а также рассмотрены и систематизированы актуальные в настоящий момент знания о перспективных видах терапевтических олигонуклеотидов с разными механизмами взаимодействия с мишенью.

На сегодняшний день рак продолжает оставаться одним из самых опасных заболеваний, ежегодно становясь причиной гибели >9 млн человек в мире. Поэтому востребованы новые более эффективные методы терапии рака. Иммунотерапия на основе моноклональных антител уже показала свою эффективность, а конъюгаты антител с лекарством (antibody-drug conjugates, ADC), как один из ее успешных вариантов, имеют значительный и еще не полностью реализованный потенциал. ADC представляют собой моноклональные антитела, связанные посредством линкеров с цитотоксическими препаратами. ADC во многих клинических испытаниях и уже в стандартной клинической практике продемонстрировали значимые преимущества по сравнению с комбинированной терапией немодифицированными антителами и химиопрепаратами. Благодаря новым достижениям в области молекулярной иммунологии и биотехнологии потенциал ADC оценивается как прорывной, это позволит им стать наиболее востребованными противоопухолевыми препаратами уже в ближайшие годы. ADC способны прицельно доставлять лекарственные препараты в опухолевые клетки, не оказывая при этом значительного токсического воздействия на здоровые ткани и органы. К настоящему времени в мире для использования в клинике одобрено 15 препаратов ADC, еще более сотни препаратов данного класса находятся на разных стадиях клинических испытаний. В то же время терапия с использованием ADC связана с определенными побочными эффектами и ограниченной эффективностью, в связи с чем существует необходимость в разработке более совершенных конъюгатов. В данном обзоре рассмотрены история развития ADC как терапевтического класса лекарств, их строение, мишени и механизм действия, а также обозначены перспективы и направления дальнейшей разработки данного класса противоопухолевых препаратов.

Трансферрин (Tf) в плазме крови существует в двух формах: железосодержащей holo-Tf и железонесодержащей apo-Tf формах. Количественное соотношение этих форм в плазме крови человека – важный биохимический маркер заболеваний, связанных с дефицитом или избытком железа. Применение метода поляризационного флуоресцентного иммуноанализа (FPIA) и использование рекомбинантных нанотел верблюда в качестве распознающего реагента для экспрессного определения holo-Tf и apo-Tf позволит разработать быстрые метод определения двух конформаций трансферрина. Синтезированы и охарактеризованы конъюгаты нанотел верблюда aTf1 и aTf2 к holo- и аpo-формам Tf человека c флуоресцеинизотиоцианатом (FITC). Подобраны концентрации конъюгатов FITC-aTf1 и FITC-aTf2 (2.5–5 нМ) с оптимальным соотношением сигнал/шум и исследована кинетика связывания FITC-aTf1 и FITC-aTf2 с holo- и apo-Tf методом поляризации флуоресценции. Показано, что полное связывание конъюгатов FITC-aTf1 и FITC-aTf2 с holo- и apo-Tf наблюдается через 15 и 5 мин инкубации соответственно. Определены равновесные константы диссоциации комплексов FITC-aTf1*holo-Tf и FITC-aTf2*apo-Tf, которые составили 30.7 ± 0.3 и 15.3 ± 0.2 нМ, соответственно. Продемонстрировано, что инкубация конъюгатов FITC-aTf1 и FITC-aTf2 с другими белками человека – лактоферрином, сывороточным альбумином и лизоцимом – не приводит к изменению сигнала поляризации флуоресценции, что свидетельствует о высокой специфичности анализа. Показано, что пары реагентов FITC-aTf1/apo-Tf и FITC-aTf2/holo-Tf не демонстрировали связывания между собой, что подтверждает аффинность конъюгатов FITC-aTf1 и FITC-aTf2 к holo- и apo-Tf, соответственно. В данной работе показана возможность определения двух форм трансферрина в физиологических жидкостях человека методом FPIA, которое может иметь диагностическое значение, а применение портативного флуоресцентного анализатора позволит проводить данный анализ вне стен специализированных лабораторий.

Получена новая генетически кодируемая флуоресцентная метка picoFAST, которая содержит всего 88 а.о. и на данный момент выступает наименьшим флуороген-активирующим белком. Показано, что комплекс белка picoFAST с флуорогеном HBR-DOM2 может быть использован в качестве генетически-кодируемой флуоресцентной метки для окрашивания отдельных структур живых клеток.

Представлен новый вариант синтетических аналогов олигонуклеотидов, содержащих одновременно два типа модификаций – фосфорилгуанидиновую (PG) межнуклеотидную группу и 2ʹ,4ʹ-замкнутые фрагменты рибозы (LNA) – в составе одного нуклеотидного звена. Показано, что при наличии PG-LNA-звеньев снижается электрофоретическая подвижность олигонуклеотидов, что прежде всего связано с электронейтральностью PG-группы. Также PG-LNA-модификации увеличивают гидрофобность олигонуклеотидов, вследствие чего они характеризуются бо́льшим временем удерживания при обращенно-фазовой хроматографии. Исследована термическая стабильность комплементарных дуплексов, содержащих PG-LNA-олигонуклеотиды. Показано, что температура плавления возрастает на 1.5–4.0°C на модификацию в зависимости от расположения модифицированного звена и ионной силы раствора. При этом методом спектрополяриметрии кругового дихроизма установлено, что пространственная структура комплексов, образованных PG-LNA, отличается от B-формы, что может быть обусловлено наличием LNA-фрагментов, имеющих 3'-эндо-конформацию рибозного кольца. Таким образом, PG-LNA-олигонуклеотиды можно рассматривать как новый частично незаряженный структурный аналог РНК. Основываясь на полученных данных, можно заключить, что PG-LNA-олигонуклеотиды могут быть перспективным инструментом для различных методов выделения и анализа нуклеиновых кислот.

Порообразующий токсин гемолизин II (HlyII), секретируемый грамположительной бактерией Bacillus cereus, – один из основных патогенных факторов данного микроорганизма. Действие HlyII приводит к лизису клеток вследствие порообразования на мембранах. Гибридомной технологией получены моноклональные антитела против большого С-концевого фрагмента (Met225–Ile412, HlyIILCTD) HlyII B. cereus с использованием в качестве антигена рекомбинантной растворимой формы HlyIILCTD, которую получали с использованием белка-шаперона SlyD. Моноклональное антитело LCTD-83 ингибировало гемолитическую активность HlyII, степень защиты зависела от присутствия/отсутствия пролина в положении 324 в первичной последовательности токсина. Наиболее эффективно антитело ингибировало гемолиз эритроцитов, вызванный HlyII B-771, в последовательности которого в положении 324 присутствует Рro вместо Leu. Показано, что антитело LCTD-83 взаимодействует с образовавшимися порами на мембранах эритроцитов, блокируя при этом возможный выход внутриклеточного содержимого. HlyII и его мутантные формы получали с использованием рекомбинантных штаммов-продуцентов Escherichia coli BL21(DE3). Способность антител узнавать антигены характеризовали иммуноферментным анализом (ИФА) и иммуноблоттингом, иммунопреципитацию использовали для демонстрации взаимодействия с мембранными порами, сформированными токсином. LCTD-83 менее эффективно взаимодействовало с полноразмерным токсином, чем с HlyIILCTD, что подтвердило тот факт, что порообразование сопровождается изменением конформации токсина. В связи с этим для подавления цитолитического действия гемолизина II перспективны антитела, взаимодействующие с его олигомерной формой. LCTD-83 обладает потенциалом при выявлении путей нейтрализации токсина.

Полиоксометаллаты платины – комплексы Pt (IV), содержащие объемные кластерные лиганды. Ранее было показано, что полиоксониобат платины структуры [(Nb₆O₁₉)₂{Pt(OH)₂}₂]¹²⁻ (Pt-PON1), содержащий два платиновых центра, способен образовывать ковалентный конъюгат с ДНК. В настоящей работе исследована структурная стабильность Pt-PON1 и его конъюгата с гуанином по положению N7, цитотоксичность этого соединения и его накопление клетками. Квантово-механическое моделирование показало, что комплекс Pt-PON1 нестабилен вне кристаллической решетки, а его конъюгат с гуанином должен достаточно легко претерпевать структурную перестройку. Наблюдалось значительное снижение выживаемости Escherichia coli штаммов XL1-Blue и DH5α и клеток человека линий HEK293T и MCF-7 в присутствии Pt-PON1 уже в концентрации 20 мкМ, однако при более высоких концентрациях соединение было малорастворимо в биологически совместимых средах. Методом атомно-эмиссионной спектроскопии по Pt и Nb показано, что Pt-PON1 эффективно поглощается клетками человека в стехиометрии, соответствующей исходному комплексу. Таким образом, полиоксометаллаты платины при условии решения проблемы растворимости могут рассматриваться как перспективные противоопухолевые агенты.