Organization of the Reserve Pool of Synaptic Vesicles in Nerve Terminals Lacking Protein Liquid Phase Components

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Резервный пул синаптических везикул (СВ) – специализированный немембранный компартмент химического синапса, находящийся на расстоянии около 100 нм над активной зоной и содержащий везикулы, заполненные нейромедиатором, которые используются для синаптической передачи при повышенной активности синапса [1, 2]. Истощение запаса СВ в резервном пуле (РП) приводит к невозможности длительного поддержания синаптической передачи и к синаптической депрессии. Основным структурным компонентом РП является белок синапсин, способный при определенных условиях переходить из растворимого состояния в состояние жидкой фазы, образуя белковый конденсат, включающий в себя СВ [3–5]. В состоянии покоя в РП также локализуется ряд эндоцитозных белков [6], в частности N-BAR белок эндофилин А [6–8].

Исследования, проведенные с изолированными белками, показали, что эндофилин способен образовать жидкую фазу вместе в синапсином. Его присутствие позволяет войти в состав жидкой фазы целому ряду других белков, находящихся в РП in vivo, таких как интерсектин, динамин и амфифизин [9]. Это свойство делает эндофилин кандидатом на роль главного регулятора состава жидкой фазы и структуры РП. Выполняет ли эндофилин эту функцию в живом синапсе, остается неизвестным.

В данной работе мы исследовали эффект удаления генов эндофилина на организацию РП в синапсах, образованных кортикальными нейронами в культуре, в состоянии покоя.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культуры клеток и электронная микроскопия. Кортикальные нейроны с тройным нокаутом по генам эндофилина А1–3 (EndoTKO; n = 3), с двойным нокаутом по генам динамина 1,3 (Dyn1,3DKO; n = 3) и контрольных животных (n = 3) культивировали согласно описанному ранее протоколу [7, 10, 11]. Мыши EndoTKO и Dyn1,3DKO получены скрещиванием животных с нокаутом отдельных генов, как описано ранее [10, 11]. Препараты культур нейронов были приготовлены в лаборатории P. De Camilli (Yale University School of Medicine, USA) и любезно предоставлены проф. P. De Camilli. Первичные культуры клеток получали из животных на стадии развития P0 в одинаковых условиях. Нейроны фиксировали через 2 недели in vitro в 1.3% глутаровом альдегиде, приготовленном на 66 мМ натрий-какодилатном буфере, постфиксировали в 1% OsO₄, 1.5% K₄Fe(CN)₆ в 0.1M натрий-какодилатном буфере, окрашивали в 0.5% уранилацетате, дегидратировали в спиртах, заключали в смолу Embed 812 (EMS). Серии из 5–10 ультратонких 70-нм срезов изготавливали на ультратоме Leica UC и помещали на покрытые формваром бленды. Срезы контрастировали в 1% водном растворе уранилацетата и цитрата свинца, исследовали с помощью трансмиссионного электронного микроскопа Jeol-1400 с камерой Olympus-SIS Veleta (2048×2048), фотографировали на увеличениях ×30000 и ×50000.

Анализ изображений и статистика. Синапсы отбирали случайным образом на серийных срезах. Для сравнения гомогенных популяций в различных культурах исследования проводили на асимметричных синапсах. Для анализа электронных микрофотографий и измерения параметров РП использовали ПО Image J. Значения площади РП на идентифицированном центральном срезе синапса нормализовали к длине активной зоны. На некоторых срезах было сложно провести измерение всех интересующих структур, например, из-за наклонной ориентации плоскости среза. С этим связаны различия в количестве измерений отдельных параметров в графиках. Статистическую обработку данных проводили с помощью ПО Prism 9 (GraphPad).

РЕЗУЛЬТАТЫ

При тройном нокауте по генам эндофилина А1–3 (EndoTKO) фенотипическим признаком межнейронных синапсов на ультраструктурном уровне является наличие клатриновых везикул в непосредственной близости от активной зоны [10]. Это связано с тем, что основной функцией эндофилина при эндоцитозе является привлечение (рекрутинг) к мембране везикул фосфоинозитидфосфатазы синаптоянина, которая запускает процесс снятия клатринового окаймления [10, 12]. Действительно, в синапсах EndoTKO вокруг кластера СВ мы обнаружили клатрин-окаймленные везикулы (КВ) (рис. 1в). Преимущественно КВ находились на расстоянии до 200 нм от границы кластера. Количество КВ в этой зоне составило в среднем 24.82 против 2.92 КВ/мкм² в контроле (p < 0.0001, t-тест; рис. 1и). В ряде случаев КВ наблюдали в аксоплазме на расстоянии более 1 мкм от границы кластера (максимум – 1.44 мкм), далеко за пределами зоны эндоцитоза.

Синапсы EndoTKO имели выраженные кластеры СВ, включающие везикулы РП (рис. 1в). Площадь РП в синапсах EndoTKO была в среднем в 1.6 раза меньше, чем в контроле (p = 0.0108, t-тест; рис. 1з), что объясняется замедлением эндоцитоза в синапсах. Неполное блокирование клатрин-зависимого эндоцитоза, вероятно, является следствием частичного дублирования функций эндофилина другими белками, такими как интерсектин и амфифизин, которые имеют свойство взаимодействовать с партнерами эндофилина [13]. Чтобы выяснить, повлияло ли отсутствие эндофилина на структуру РП, мы измерили плотность расположения СВ в кластерах синапсов EndoTKO и в контроле. Статистически значимых различий между этими группами выявлено не было (t-тест; рис. 1ж).

Для сравнения мы исследовали плотность расположения СВ в синапсах с двойным нокаутом по генам динамина (Dyn1,3DKO). Как и синаптоянин, динамины 1,3 взаимодействуют с эндофилином в процессе эндоцитоза [8] и необходимы для поддержания эндоцитоза в центральных синапсах [11]. Фенотип Dyn1,3DKO характеризуется многочисленными инвагинациями пресинаптической мембраны, образующими клатрин-окаймленные ямки [11, 14], что также наблюдалось в наших экспериментах. Размеры РП были значительно уменьшены (рис. 1д, 1з). Кластеры СВ были обнаружены только в отдельных синапсах, а в большинстве отсутствовали, что объясняется полной блокадой клатрин-зависимого эндоцитоза в отсутствие динамина и неспособностью клатрин-независимых механизмов эффективно формировать СВ [11]. Плотность везикул в РП оказалась существенно выше в синапсах Dyn1,3DKO по сравнению с EndoTKO (p < 0.0001) (рис. 1г, 1е, 1ж). Различий в средней длине активной зоны в исследованных синапсах обнаружено не было (рис. 1к).

 

Рис. 1. Эффекты удаления генов эндофилина и динамина на организацию резервного пула СВ в асимметричных синапсах в культуре кортикальных нейронов.

а, в, д – Электронные микрофотографии асимметричных синапсов в контрольной культуре нейронов (а), в культуре нейронов с тройным нокаутом по генам эндофилина (в) и с двойным нокаутом по генам динамина 1 и 3 (д) в покое. Зоны, содержащие клатриновые везикулы (в) и клатрин-окаймленные ямки (д), выделены белой рамкой и показаны на вставках при большем увеличении. На микрофотографиях б, г, е участки РП, изображенных на а, в, д, показаны при большем увеличении. Масштаб для а, в, д: 500 нм; для вставок на в, д: 100 нм; для б, г, е: 100 нм. Обозначения: а – аксон, д – дендрит, СВ – синаптические везикулы, РП – резервный пул СВ, мх – митохондрия, КВ – клатрин-окаймленные везикулы, КЯ – клатрин-окаймленные ямки, черная стрелка – активная зона. ж, з –Плотность (ж) и площадь (з) резервных пулов в контрольных, EndoTKO и Dyn1,3DKO синапсах; площадь РП нормализована к длине активной зоны. и – Плотность КВ в зоне 200 нм от границы РП в контрольных и EndoTKO синапсах. к – Средняя длина активных зон в исследованных группах. Данные представлены как среднее ± SEM. Цифры над столбцами указывают число исследованных синапсов.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Исследования последних лет показали, что ключевую роль в организации жидкой фазы везикул РП играет белок синапсин [4, 5]. Наличие дополнительных белков в составе РП позволяет менять свойства жидкой фазы, вследствие чего может изменяться динамика и организация РП при синаптической активности [3]. Так, в исследованиях in vitro было показано, что жидкая фаза СВ и синапсина способна рекрутировать α-синуклеин, что снижает плотность СВ в кластере [15]. В гиппокампальных синапсах с тройным нокаутом генов α, β, γ-синуклеинов везикулы РП кластеризуются плотнее, чем в синапсах дикого типа [16]. В отношении эндоцитозных белков, находящихся в РП в состоянии покоя и имеющих SH3-домены, способные взаимодействовать с синапсином, также высказывались предположения, что они регулируют восстановление структуры РП при рекластеризации СВ после синаптической активности и необходимы для поддержания этой структуры в покое [13].

В недавних исследованиях было показано, что эндоцитозный белок эндофилин способен формировать жидкую фазу совместно с синапсином in vitro [9]. Коэкспрессия эндофилина и синапсина в COS7 клетках повышала способность смешанной жидкой фазы кластеризовать СВ-подобные везикулы и увеличивала площадь таких псевдо-синаптических кластеров. Однако какое значение имеет эндофилин для поддержания структуры РП в живом синапсе, осталось невыясненным [9].

В настоящей работе на кортикальных нейронах мы показали, что генетическое удаление эндофилинов А1, А2 и А3 в синапсах не нарушает плотность упаковки везикул в РП, что указывает на то, что эндофилин и белки, которые включаются в резервный пул с его помощью, не оказывают существенного влияния на организацию жидкой фазы СВ. Неожиданным оказалось значительное увеличение плотности везикул в РП при удалении динаминов 1 и 3. Возможным объяснением этому может быть отсутствие дублирования функций динамина при организации жидкой фазы. Для выяснения роли динамина в организации РП нужны дальнейшие исследования.

Источники финансирования. Работа выполнена при поддержке РНФ (№ 21–15–00227) и Шведского Совета по научным исследованиям (grants 2020–01731, 2020–01952), Шведского фонда исследований мозга (Hjärnfonden), а также гранта СПбГУ (ID93026594). Мы бы хотели поблагодарить д-ра I. Milosević (University of Oxford) за помощь в получении культур и обсуждении результатов.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Соответствие принципам этики. Работа выполнена с соблюдением международных принципов по использованию животных.

About the authors

N. V. Nifantova

Institute of Translational Biomedicine, St. Petersburg State University

Author for correspondence.
Email: oleg.shupliakov@ki.se
Russian Federation, St. Petersburg, 199034

A. G. Shishkov

Institute of Translational Biomedicine, St. Petersburg State University

Email: oleg.shupliakov@ki.se
Russian Federation, St. Petersburg, 199034

O. M. Korenkova

Institute of Translational Biomedicine, St. Petersburg State University

Email: oleg.shupliakov@ki.se
Russian Federation, St. Petersburg, 199034

E. Sopova

Institute of Translational Biomedicine, St. Petersburg State University; Karolinska Institutet

Email: oleg.shupliakov@ki.se
Russian Federation, St. Petersburg, 199034; Stockholm, 17177, Sweden

L. Brodin

Karolinska Institutet

Email: oleg.shupliakov@ki.se
Sweden, Stockholm, 17177

O. Shupliakov

Institute of Translational Biomedicine, St. Petersburg State University; Karolinska Institutet

Email: oleg.shupliakov@ki.se
Russian Federation, St. Petersburg, 199034; Stockholm, 17177, Sweden

References

Supplementary files