Glass or plastic? Influence of funnel material on the efficiency of nematode extraction using the Baermann method

Texto integral

Нематоды – одна из наиболее распространенных и многочисленных групп беспозвоночных: они встречаются практически повсюду [1], а численность может достигать 20 млн экз./м² [2]. Обилие нематод – важный индикатор состояния почвы [3–5]. Для корректной оценки численности и возможности сравнивать величины, полученные в разных исследованиях, необходима стандартизация методики экстракции. Выделение нематод методом Бермана – наиболее часто используемая техника, разработанная еще в начале ХХ в. и неоднократно модифицированная в целях максимизации эффективности [6]. При ее стандартизации уделяли внимание выбору оптимального времени экстракции, массе пробы, количеству воды [6], а также рассматривали вариации оборудования: сита с разным размером ячеек, разные типы фильтров [7, 8]. Однако вопрос о возможности оседания нематод на стенках экстракционных воронок, а также о влиянии материала, из которого они изготовлены, на эффективность экстракции ранее не рассматривался. Между тем в разных исследованиях используют воронки как из стекла [9–11], так и из пластика [12–14]. Чаще всего авторы вообще не указывают материал воронки, например [7, 15]. Цель данной работы – ответить на вопрос, влияет ли материал воронок на эффективность экстракции нематод.

Отбор образцов почвы (органический и органоминеральный горизонты) проводили на двух участках соснового леса в парковой зоне г. Екатеринбурга (Юго-Западный лесопарк и территория Ботанического сада УрО РАН). На обоих участках с каждой из 5 пробных площадей отобрали по 5 образцов из каждого горизонта с помощью лопатки и рамки (10×10 см) на глубину 5 см. Расстояние между точками сбора составляло не менее 2 м, между пробными площадями – 150 м. Затем образцы каждого горизонта, отобранные с одной площадки, объединяли и тщательно перемешивали, чтобы добиться гомогенности пробы. Объединенную пробу делили на 6 равных частей (органический горизонт – 10 г, органоминеральный – 25 г, с точностью 0.02 г) – подпроб. Для экстракции нематод из каждой пробы (6 подпроб) одновременно были использованы три стеклянные и три пластиковые воронки (полиэтилен низкого давления, марка Gigant GT-67830). Диаметр всех типов воронок был равен 16 см, угол наклона стеклянной воронки составлял 60°, пластиковой – 50°, остальное оборудование было идентичным (рис. 1). Также было использовано стальное сито диаметром 14 см, не касающееся стенок воронки, размер ячеек составлял 100 мкм.

Рис. 1. Сборная конструкция стеклянной (а) и пластиковой (б) воронки для экстракции нематод методом Бермана.

В соответствии со стандартным протоколом метода Бермана экстракцию нематод проводили с помощью установки, состоящей из воронки, силиконовой трубки и пробирки объемом 2 мл. Сито с фильтром (тонкая бумажная салфетка) и помещенной на него пробой ставили в воронку и заполняли систему водой так, чтобы вода смачивала образец, но не покрывала его полностью. Длительность экстракции составляла 48 ч при комнатной температуре в темноте. После снятия сита с образцом и стравливания оставшейся в установке воды делали смывы нематод в отдельную пробирку со стенок воронок с помощью лабораторной промывалки одним круговым движением. Таким образом было получено 120 пробирок с суспензией нематод (2 горизонта × 10 площадок × 6 подпроб), а также 100 пробирок со смывами со стенок воронок (20 смывов не были сделаны по техническим причинам).

Для подсчета численности нематод из каждой пробирки объемом 1 мл после встряхивания было отобрано по 3 аликвоты (0.1 мл). Численность нематод (экз./100 г) рассчитывали как среднее количество нематод в аликвоте, умноженное на 10, а затем нормированное на сухую массу подпробы. Для анализа данных и визуализации использовали пакеты nlme, ggpubr и multcomp в среде программирования Rv.4.2.2 [16]. Статистический анализ включал двухфакторный дисперсионный анализ: фиксированные факторы – материал воронки, почвенный горизонт и их взаимодействие (далее «материал × горизонт»), случайный фактор – площадка. Множественные сравнения выполнили с использованием критерия Тьюки. Величины численности были предварительно логарифмированы, а данные, выраженные в долях от единицы, преобразованы в arcsin (√ p).

Численность нематод органического и органоминерального горизонтов составила (медиана, в скобках доверительный интервал) 13 114 (12 229 – 15 257) и 3271 (3055–3985) экз/100 г. соответственно (рис. 2), что согласуется с данными для средней и южной тайги [17–19]. В минеральном горизонте, содержащем меньше органических остатков по сравнению с лесной подстилкой, плотность нематод существенно ниже (F (1;105) = 392.7; p < 0.001, рис. 2а), что также хорошо согласуется с литературными данными [19, 20].

Рис. 2. Влияние материала воронки и горизонта на численность экстрагированных нематод (а); численность нематод, смытых со стенок воронок (б); суммарная численность нематод (экстрагированных и смытых) (в); процент потерь нематод (г) (численность рассчитана на сухую массу почвы, n = 120). Серая заливка – органический горизонт, белая – органоминеральный горизонт. Одинаковые буквы означают отсутствие статистически значимых различий по критерию Тьюки (p < 0.05): заглавные буквы использованы при сравнении вариантов для органического горизонта, а строчные – для органоминерального. Горизонтальная черта – медиана, границы ящика – межквартильный размах, усы – размах, точка – выброс.

Численность нематод, экстрагированных с помощью пластиковой воронки, значимо больше, чем с помощью стеклянной (F (1;105) = 8.7; p = 0.039), при отсутствии взаимодействия факторов «материал × горизонт» (F (1;105) = 2.16; p = 0.144). При использовании критерия Тьюки различия в численности экстрагированных нематод обнаружены только для органоминерального горизонта (см. рис. 2а). Таким образом, материал воронки влияет на эффективность экстракции нематод. Более выражено влияние на результаты экстракции из образцов с низкой численностью нематод.

Численность нематод, остающихся на стенках воронок, также зависит от материала воронки (F (1;87) = 61.1; p < 0.001) – на стеклянных воронках их остается больше (см. рис. 2б). Взаимодействие факторов также статистически незначимо (F (1;87) = 2.19; p = 0.14). Усредненные по горизонтам потери нематод со стеклянных воронок составили 21.7 (17.4–25.2)%, тогда как с пластиковых почти в 3 раза меньше – 7.6 (6.4–8.8)% (см. рис. 2г). Авторы большинства работ и учебных пособий не упоминают о необходимости смыва нематод со стенок воронок по окончании экстракции [6, 7, 21]. Между тем полученные нами данные свидетельствуют о значительном смещении оценок обилия нематод из-за их оседания на стенках, причем при использовании любого материала воронок.

Различия между разными типами воронок объяснимы с точки зрения свойств материалов: стекло обладает гидрофильными свойствами [22], а значит, что во время экстракции на него налипает больше нематод по сравнению с пластиком. Также отметим, что в нашем эксперименте угол стеклянных воронок меньше по сравнению с пластиковыми, а потери, наоборот, больше. Это означает, что при одинаковом угле наклона не исключена еще большая разница в эффективности экстракции между воронками из данных материалов.

Суммарная численность нематод, т. е. сумма экстрагированных из образца и смытых со стенок, не различается между разными типами воронок: F (1;87) = 1.52; p = 0.22 (см. рис. 2в), взаимодействия факторов незначимы (F (1;87) = 1.23; p = 0.27). Это свидетельствует о том, что смывы с воронок нивелируют погрешность экстракции, вызванную адгезией нематод на стенки воронок.

Таким образом, выбор материала для воронок важен, поскольку он влияет на оценки численности нематод из-за различий в доле особей, оседающих на их стенках. Поэтому необходимо осторожно подходить к объединению данных разных исследований, если в публикациях не указан материал воронок. Смыв нематод, оставшихся на стенках воронок, позволяет снизить недооценку их численности, но в несколько раз увеличивает время работы, что нежелательно из-за короткого срока хранения образцов. Альтернативой смыву нематод со стенок для минимизации потерь может быть использование воронок и других компонентов установки из материалов с гидрофобными свойствами.

Анализ данных и подготовка рукописи выполнены в рамках государственного задания Института экологии растений и животных УрО РАН (проект № 122021000076-9). Автор выражает благодарность А. И. Ермакову за общую идею работы, Г. Ю. Смирнову и Т. Н. Орехову – за помощь на всех этапах работы, О. В. Дуле и Е. Л. Воробейчику – за обсуждение результатов, а также двум анонимным рецензентам за полезные замечания.

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.

Sobre autores

A. Loginova

Autor responsável pela correspondência
Email: loginova_ad@ipae.uran.ru
Rússia, 620144, Ekaterinburg

Bibliografia

Arquivos suplementares

Arquivos suplementares

Ação

1. JATS XML

Baixar

2. Fig. 1. Prefabricated construction of glass (a) and plastic (b) funnels for nematode extraction by the Berman method.

Baixar (80KB)

Metadados

3. Fig. 2. The effect of the funnel and horizon material on the number of extracted nematodes (a); the number of nematodes washed off the walls of the funnels (b); the total number of nematodes (extracted and washed away) (c); the percentage of nematode losses (d) (the number is calculated for the dry mass of the soil, n = 120). The gray fill is the organic horizon, the white one is the organomineral horizon. Identical letters mean that there are no statistically significant differences according to the Tukey criterion (p < 0.05): capital letters are used when comparing variants for the organic horizon, and lowercase letters are used for the organomineral one. The horizontal line is the median, the boundaries of the box are the interquartile span, the whiskers are the span, the point is the outlier.

Baixar (166KB)

Metadados