Стекло или пластик? Влияние материала воронки на эффективность экстракции нематод методом Бермана

Полный текст

Нематоды – одна из наиболее распространенных и многочисленных групп беспозвоночных: они встречаются практически повсюду [1], а численность может достигать 20 млн экз./м² [2]. Обилие нематод – важный индикатор состояния почвы [3–5]. Для корректной оценки численности и возможности сравнивать величины, полученные в разных исследованиях, необходима стандартизация методики экстракции. Выделение нематод методом Бермана – наиболее часто используемая техника, разработанная еще в начале ХХ в. и неоднократно модифицированная в целях максимизации эффективности [6]. При ее стандартизации уделяли внимание выбору оптимального времени экстракции, массе пробы, количеству воды [6], а также рассматривали вариации оборудования: сита с разным размером ячеек, разные типы фильтров [7, 8]. Однако вопрос о возможности оседания нематод на стенках экстракционных воронок, а также о влиянии материала, из которого они изготовлены, на эффективность экстракции ранее не рассматривался. Между тем в разных исследованиях используют воронки как из стекла [9–11], так и из пластика [12–14]. Чаще всего авторы вообще не указывают материал воронки, например [7, 15]. Цель данной работы – ответить на вопрос, влияет ли материал воронок на эффективность экстракции нематод.

Отбор образцов почвы (органический и органоминеральный горизонты) проводили на двух участках соснового леса в парковой зоне г. Екатеринбурга (Юго-Западный лесопарк и территория Ботанического сада УрО РАН). На обоих участках с каждой из 5 пробных площадей отобрали по 5 образцов из каждого горизонта с помощью лопатки и рамки (10×10 см) на глубину 5 см. Расстояние между точками сбора составляло не менее 2 м, между пробными площадями – 150 м. Затем образцы каждого горизонта, отобранные с одной площадки, объединяли и тщательно перемешивали, чтобы добиться гомогенности пробы. Объединенную пробу делили на 6 равных частей (органический горизонт – 10 г, органоминеральный – 25 г, с точностью 0.02 г) – подпроб. Для экстракции нематод из каждой пробы (6 подпроб) одновременно были использованы три стеклянные и три пластиковые воронки (полиэтилен низкого давления, марка Gigant GT-67830). Диаметр всех типов воронок был равен 16 см, угол наклона стеклянной воронки составлял 60°, пластиковой – 50°, остальное оборудование было идентичным (рис. 1). Также было использовано стальное сито диаметром 14 см, не касающееся стенок воронки, размер ячеек составлял 100 мкм.

Рис. 1. Сборная конструкция стеклянной (а) и пластиковой (б) воронки для экстракции нематод методом Бермана.

В соответствии со стандартным протоколом метода Бермана экстракцию нематод проводили с помощью установки, состоящей из воронки, силиконовой трубки и пробирки объемом 2 мл. Сито с фильтром (тонкая бумажная салфетка) и помещенной на него пробой ставили в воронку и заполняли систему водой так, чтобы вода смачивала образец, но не покрывала его полностью. Длительность экстракции составляла 48 ч при комнатной температуре в темноте. После снятия сита с образцом и стравливания оставшейся в установке воды делали смывы нематод в отдельную пробирку со стенок воронок с помощью лабораторной промывалки одним круговым движением. Таким образом было получено 120 пробирок с суспензией нематод (2 горизонта × 10 площадок × 6 подпроб), а также 100 пробирок со смывами со стенок воронок (20 смывов не были сделаны по техническим причинам).

Для подсчета численности нематод из каждой пробирки объемом 1 мл после встряхивания было отобрано по 3 аликвоты (0.1 мл). Численность нематод (экз./100 г) рассчитывали как среднее количество нематод в аликвоте, умноженное на 10, а затем нормированное на сухую массу подпробы. Для анализа данных и визуализации использовали пакеты nlme, ggpubr и multcomp в среде программирования Rv.4.2.2 [16]. Статистический анализ включал двухфакторный дисперсионный анализ: фиксированные факторы – материал воронки, почвенный горизонт и их взаимодействие (далее «материал × горизонт»), случайный фактор – площадка. Множественные сравнения выполнили с использованием критерия Тьюки. Величины численности были предварительно логарифмированы, а данные, выраженные в долях от единицы, преобразованы в arcsin (√ p).

Численность нематод органического и органоминерального горизонтов составила (медиана, в скобках доверительный интервал) 13 114 (12 229 – 15 257) и 3271 (3055–3985) экз/100 г. соответственно (рис. 2), что согласуется с данными для средней и южной тайги [17–19]. В минеральном горизонте, содержащем меньше органических остатков по сравнению с лесной подстилкой, плотность нематод существенно ниже (F (1;105) = 392.7; p < 0.001, рис. 2а), что также хорошо согласуется с литературными данными [19, 20].

Рис. 2. Влияние материала воронки и горизонта на численность экстрагированных нематод (а); численность нематод, смытых со стенок воронок (б); суммарная численность нематод (экстрагированных и смытых) (в); процент потерь нематод (г) (численность рассчитана на сухую массу почвы, n = 120). Серая заливка – органический горизонт, белая – органоминеральный горизонт. Одинаковые буквы означают отсутствие статистически значимых различий по критерию Тьюки (p < 0.05): заглавные буквы использованы при сравнении вариантов для органического горизонта, а строчные – для органоминерального. Горизонтальная черта – медиана, границы ящика – межквартильный размах, усы – размах, точка – выброс.

Численность нематод, экстрагированных с помощью пластиковой воронки, значимо больше, чем с помощью стеклянной (F (1;105) = 8.7; p = 0.039), при отсутствии взаимодействия факторов «материал × горизонт» (F (1;105) = 2.16; p = 0.144). При использовании критерия Тьюки различия в численности экстрагированных нематод обнаружены только для органоминерального горизонта (см. рис. 2а). Таким образом, материал воронки влияет на эффективность экстракции нематод. Более выражено влияние на результаты экстракции из образцов с низкой численностью нематод.

Численность нематод, остающихся на стенках воронок, также зависит от материала воронки (F (1;87) = 61.1; p < 0.001) – на стеклянных воронках их остается больше (см. рис. 2б). Взаимодействие факторов также статистически незначимо (F (1;87) = 2.19; p = 0.14). Усредненные по горизонтам потери нематод со стеклянных воронок составили 21.7 (17.4–25.2)%, тогда как с пластиковых почти в 3 раза меньше – 7.6 (6.4–8.8)% (см. рис. 2г). Авторы большинства работ и учебных пособий не упоминают о необходимости смыва нематод со стенок воронок по окончании экстракции [6, 7, 21]. Между тем полученные нами данные свидетельствуют о значительном смещении оценок обилия нематод из-за их оседания на стенках, причем при использовании любого материала воронок.

Различия между разными типами воронок объяснимы с точки зрения свойств материалов: стекло обладает гидрофильными свойствами [22], а значит, что во время экстракции на него налипает больше нематод по сравнению с пластиком. Также отметим, что в нашем эксперименте угол стеклянных воронок меньше по сравнению с пластиковыми, а потери, наоборот, больше. Это означает, что при одинаковом угле наклона не исключена еще большая разница в эффективности экстракции между воронками из данных материалов.

Суммарная численность нематод, т. е. сумма экстрагированных из образца и смытых со стенок, не различается между разными типами воронок: F (1;87) = 1.52; p = 0.22 (см. рис. 2в), взаимодействия факторов незначимы (F (1;87) = 1.23; p = 0.27). Это свидетельствует о том, что смывы с воронок нивелируют погрешность экстракции, вызванную адгезией нематод на стенки воронок.

Таким образом, выбор материала для воронок важен, поскольку он влияет на оценки численности нематод из-за различий в доле особей, оседающих на их стенках. Поэтому необходимо осторожно подходить к объединению данных разных исследований, если в публикациях не указан материал воронок. Смыв нематод, оставшихся на стенках воронок, позволяет снизить недооценку их численности, но в несколько раз увеличивает время работы, что нежелательно из-за короткого срока хранения образцов. Альтернативой смыву нематод со стенок для минимизации потерь может быть использование воронок и других компонентов установки из материалов с гидрофобными свойствами.

Анализ данных и подготовка рукописи выполнены в рамках государственного задания Института экологии растений и животных УрО РАН (проект № 122021000076-9). Автор выражает благодарность А. И. Ермакову за общую идею работы, Г. Ю. Смирнову и Т. Н. Орехову – за помощь на всех этапах работы, О. В. Дуле и Е. Л. Воробейчику – за обсуждение результатов, а также двум анонимным рецензентам за полезные замечания.

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

А. Д. Логинова

Автор, ответственный за переписку.
Email: loginova_ad@ipae.uran.ru
Россия, 620144, Екатеринбург

Список литературы

Дополнительные файлы

Доп. файлы

Действие

1. JATS XML

Скачать

2. Рис. 1. Сборная конструкция стеклянной (а) и пластиковой (б) воронки для экстракции нематод методом Бермана.

Скачать (80KB)

Метаданные

3. Рис. 2. Влияние материала воронки и горизонта на численность экстрагированных нематод (а); численность нематод, смытых со стенок воронок (б); суммарная численность нематод (экстрагированных и смытых) (в); процент потерь нематод (г) (численность рассчитана на сухую массу почвы, n = 120). Серая заливка – органический горизонт, белая – органоминеральный горизонт. Одинаковые буквы означают отсутствие статистически значимых различий по критерию Тьюки (p < 0.05): заглавные буквы использованы при сравнении вариантов для органического горизонта, а строчные – для органоминерального. Горизонтальная черта – медиана, границы ящика – межквартильный размах, усы – размах, точка – выброс.

Скачать (166KB)

Метаданные