Влияние внутриклеточных доменов химерных антигенных рецепторов на свойства CAR-T-клеток

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

CAR – химерный антигенный рецептор; CAR-T-клетки – Т-клетки, модифицированные химерным антигенным рецептором; ИС – иммунный синапс; ОАА – опухоль-ассоциированный антиген; FAS-L – Fas-лиганд; FAS – Fas-рецептор; ICD – внутриклеточный домен; scFv – одноцепочечный вариабельный фрагмент; VHH – вариабельный фрагмент наноантитела; CD – кластер дифференцировки; BCMA – антиген созревания B-клеток; IgSF – суперсемейство иммуноглобулинов; TNFRSF – суперсемейство рецепторов фактора некроза опухоли; TNFSF – суперсемейство фактора некроза опухоли; АПК – антигенпрезентирующая клетка; ГКГСI/II – главный комплекс гистосовместимости I и II типа; ТКР – Т-клеточный рецептор; α, β – распознающие цепи Т-клеточного рецептора; ζ, γ, δ, ε – белки группы CD3 Т-клеточного рецептора; ITAM – иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив; АК – аминокислота; Y – тирозин; Tn-клетки – наивные Т-клетки; ICOSL – лиганд рецептора ICOS; ИЛ – интерлейкин; ИФН-γ – интерферон-гамма; TNF-α – фактор некроза опухоли-альфа; Treg-клетки – регуляторные Т-клетки; FAP – белок, активирующий фибробласты; Th-клетки – Т-хелперы; Tm-клетки – Т-клетки памяти; TRAF – рецепторы, связывающие факторы, ассоциированные с рецептором фактора некроза опухоли; Tcm-клетки – Т-клетки центральной памяти; HVEM – медиатор проникновения вируса герпеса; Tem-клетки – Т-клетки эффекторной памяти; GITR – глюкокортикоид-индуцированный TNF-рецептор-связанный белок; BRS – участки некоторых молекул CD3, обогащенные положительно заряженными АК; RK – рецепторная киназа; PRS – богатая пролином последовательность CD3ε; PKC – протеинкиназа C; bCAR – химерные антигенные рецепторы, в которых сигнальные домены представлены частями различных внутриклеточных сигнальных партнеров ТКР; ZAP70KD – киназный домен ZAP70.

ВВЕДЕНИЕ

Традиционные методы лечения опухолевых заболеваний – химио- и лучевая терапия – в настоящее время достаточно часто сочетаются с относительно новыми – иммунотерапевтическими. К ним относятся терапия препаратами моноклональных антител, биспецифическими активаторами Т-клеток, а также клеточная терапия, в том числе CAR-T-клетками, на которых сфокусирован наш обзор. Постепенный сдвиг в сторону более специфичных или, как их называют, таргетных методов лечения объясняется низкой эффективностью и тяжелыми побочными реакциями традиционных методов терапии (например, системной генотоксичностью) [1], а также возросшим потенциалом новых методов терапии, что особенно ярко демонстрирует технология CAR-T-терапии в случае онкогематологических заболеваний [2]. Принцип действия CAR-T-терапии основан на распознавании поверхностных маркеров опухолевых клеток, что позволяет специфично воздействовать на них цитотоксическими CAR-Т-клетками (рис. 1).

 

Рис. 1. Механистический принцип CAR-T-терапии. Взаимодействие CAR-T-клетки с опухолевой клеткой обеспечивается специфичным распознаванием опухоль-ассоциированного антигена (ОАА) химерным рецептором. Это приводит к активации цитотоксических функций CAR-T-клетки, опосредованных выделением литических гранул с гранзимами и перфорином, а также взаимодействием Fas-лиганда (FAS-L) и Fas-рецептора (FAS). В результате наблюдается апоптоз опухолевой клетки

 

Это воздействие обеспечивается CAR, который состоит из трех основных доменов – внеклеточного, ответственного за распознавание антигена и подвижность распознающей части, трансмембранного, участвующего в формировании ИС, и внутриклеточного, содержащего костимулирующие и сигнальный домены, которые определяют весь спектр ответов CAR-T-клеток на специфическую активацию при связывании антигена. При этом внеопухолевая токсичность таких иммунотерапевтических препаратов существенно ниже по сравнению с традиционной терапией [3]. Кроме того, CAR-T-терапия, в случае успеха, позволяет сформировать популяцию специфичных клеток памяти, что обеспечивает долгую ремиссию [4]. К сожалению, несмотря на отдельные успехи в применении CAR-T-клеток, остаются пациенты, которым CAR-T-терапия в существующем виде помогает лишь временно, в силу недостаточной персистенции или цитотоксичности высокоперсонализированных клеточных препаратов. Поэтому усилия исследователей направлены на повышение эффективности CAR-T-терапии. Одним из ключевых факторов этого является эффективность передачи сигнала от CAR на мембране внутрь клеток, что вызывает активацию транскрипционных программ, ответственных за цитотоксичность, выживание активированных клеток, их пролиферацию, секрецию цитокинов и литических гранул, метаболизм и другие функции. За передачу сигнала отвечают внутриклеточные домены (ICD – intracellular domain) CAR, оптимизации структуры которых посвящен данный обзор.

КОСТИМУЛИРУЮЩИЕ ДОМЕНЫ

В CAR-T-клеточных препаратах, одобренных для клинического применения, роль костимулирующих доменов выполняют внутриклеточные части достаточно хорошо изученных костимулирующих мембранных молекул Т-клеток – CD28 и 4-1BB [5] (рис. 2).

 

Рис. 2. Одобренные к применению CAR-T-клеточные препараты. Показаны основные домены, обеспечивающие распознавание и передачу сигнала внутриклеточным партнерам. scFv – одноцепочечный вариабельный фрагмент; VHH – вариабельный фрагмент наноантитела; CD – кластер дифференцировки; BCMA – антиген созревания B-клеток

 

Эти мембранные белки относятся к двум суперсемействам – иммуноглобулиновому (IgSF – immunoglobulin superfamily) и семейству рецепторов фактора некроза опухоли (TNFRSF – tumor necrosis factor receptor superfamily) соответственно. На разных стадиях разработки находятся CAR с другими костимулирующими доменами, которые также входят в эти семейства – ICOS, OX40, CD27 и др. (рис. 3).

 

Рис. 3. Основные суперсемейства Т-клеточных костимулирующих рецепторов. Показана общая схема активации Т-клеток, для которой необходим основной сигнал и костимулирующие, обеспечиваемые взаимодействием как ТКР с главным комплексом гистосовместимости, так и активирующих рецепторов – представителей IgSF и TNFRSF – со своими лигандами. У рецепторов обозначены аминокислотные последовательности основных сигнальных мотивов. АПК – антигенпрезентирующая клетка; ГКГСI/II – главный комплекс гистосовместимости I и II типа; IgSF – суперсемейство иммуноглобулинов; TNFRSF – суперсемейство рецепторов фактора некроза опухоли; TNFSF – суперсемейство фактора некроза опухоли; ТКР – Т-клеточный рецептор; α, β – распознающие цепи Т-клеточного рецептора; ζ, γ, δ, ε – белки группы CD3 Т-клеточного рецептора; ITAM – иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив

 

Суперсемейство иммуноглобулинов

Среди рецепторов, относящихся к IgSF, молекулы CD28 и ICOS функционируют как стимуляторы Т-клеток за счет консервативного мотива YXXM (X – любая аминокислота (АК)), содержащего остаток тирозина (Y), который при активации фосфорилируется, что стимулирует взаимодействие с внутриклеточными сигнальными партнерами, в том числе с различными киназами.

CD28. CD28 был первым костимулятором, использованным для получения модифицированных T-клеток, содержащих CAR второго поколения [6], которые обладали преимуществами в персистенции и секреции цитокинов по сравнению с клетками первого поколения, содержащими только сигнальный домен CD3ζ [7]. Сигналы CD28 критически важны для активации наивных Т-клеток (Tn – naive T cell), так как предохраняют эти клетки от анергии [8], а также поддерживают такие процессы, как секреция цитокинов, пролиферация Т-клеток и их дифференцировка в эффекторные клетки. Взаимодействие CD28 с несколькими лигандами, в числе которых CD80 (B7-1), CD86 (B7-2) и B7-H2 (ICOSL), который одновременно является лигандом ICOS, приводит к его активации. Функциональные мотивы во внутриклеточной части CD28 – проксимальные (YMNM, PRRP) и дистальный (PYAP) (рис. 3) – связывают киназы с доменами SH2 и/или SH3 (YMNM – SHIP1, SLP76, GRAP, CBL, PI3K, GRB2 и GADS; PRRP – ITK; PYAP – PDK1, PKCθ, GRB2, STS1/2, CIN85, CD2AP, LCK и FLNA). Фиксация киназ на костимуляторе обеспечивает изменение их конформации, активацию и последующие взаимодействия киназ с нижележащими участниками сигнальных каскадов, которые, с одной стороны, приводят к активации транскрипционных факторов NFAT, AP-1 и NF-ϰB, ассоциированных с синтезом интерлейкина-2 (ИЛ-2) и стимуляцией Bcl-XL, а с другой, стимулируют метаболизм Т-клеток, усиливая аэробный гликолиз, поступление питательных веществ и анаболические процессы [8–10].

В конструкции CAR используют ICD CD28, который при связывании антигена с химерным рецептором ведет к активации пути PI3K/AKT, усиливая аэробный гликолиз, который позитивно влияет на эффекторные свойства Т-клеток [11]. В то же время высокий уровень гликолиза провоцирует истощение клеток и снижает их персистенцию [12]. Для преодоления этого пробуют вносить мутации в функциональные мотивы CD28. При этом мутации в каждом мотиве могут модифицировать характеристики полученных CAR-T-клеток. Так, в модели ксенотрансплантата панкреатической опухоли замена мотива YMNM на YMFM в SS1-CAR-T-клетках на основе CD28, нацеленных на мезотелин, снижает взаимодействие CD28 с GRB2, что уменьшает передачу сигналов через VAV1, снижает кальциевый ток и гиперактивацию NFAT, уменьшая истощение и дисфункцию Т-клеток и повышая их персистенцию и противоопухолевую эффективность [12]. CD28 с заменой мотивов PRRP и YMNM на ARRA и YFNM соответственно, усиливает секрецию клетками интерферона-гамма (ИФН-γ) и фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α – tumor necrosis factor alpha), снижает уровень связанного с истощением транскрипционного фактора Nur77 и повышает цитотоксичность CD19-CAR-T-клеток, что, в результате, обеспечивает устойчивое ингибирование развития опухоли у мышей [13]. Kofler и соавт. показали, что замена в CD28 участка PYAPP на AYAAA нарушает взаимодействие мотива PYAP с киназой LCK, что снижает секрецию ИЛ-2 и подавляет зависимую от него сигнализацию, а также ослабляет ИЛ-2-зависимую пролиферацию внутриопухолевых регуляторных Т-клеток (Treg – regulatory T cells), усиливая тем самым противоопухолевую активность таких CAR-T-клеток в отношении солидных опухолей с высокой инфильтрацией Treg-клетками [14]. Кроме того, эта модификация CD28 усиливает пролиферацию, метаболизм, активацию и цитотоксичность CAR-T-клеток, нацеленных на белок, активирующий фибробласты (FAP – fibroblast activation protein). Такие клетки эффективно элиминируют опухоли в комбинации с ингибиторами иммунных контрольных точек и длительно персистируют в гуманизированных мышах с ксенотрансплантатом и у пациентов со злокачественной плевральной мезотелиомой, демонстрируя высокий уровень безопасности [15]. Так как ICD CD28 часто включают в состав CAR вместе с трансмембранным доменом, стоит отметить, что за счет этого CAR может образовывать гетеродимеры с эндогенным CD28 [16], что приводит как к тоническому сигналингу, так и к усилению эффекторных функций соответствующих CAR-T-клеток.

ICOS. Этот рецептор слабо экспрессируется в Tn-клетках до активации Т-клеточного рецептора (ТКР), однако после активации экспрессия усиливается в течение нескольких часов [17]. ICOS активирует взаимодействие с лигандом – ICOSL, которое поддерживает жизнедеятельность Т-клеток, стимулируя пролиферацию и дифференцировку по сходным с CD28 механизмам. Эти рецепторы различаются по влиянию на синтез и секрецию цитокинов. Так, CD28 стимулирует продукцию ИЛ-2, а ICOS – ИЛ-10, характерного в большей степени для Treg-клеток [18]. Кроме ИЛ-10, ICOS также стимулирует секрецию ИФН-γ, TNF-α, ИЛ-5, ИЛ-13 и ИЛ-17, что усиливает эффекторные свойства Т-клеток и дифференцировку наивных Т-хелперов (Th – T helper cell) в эффекторные клетки подтипов Th1, Th2 и Th17 [18, 19]. Как и CD28, ICOS активирует экспрессию Bcl-XL, что повышает жизнеспособность Т-клеток [20]. Функциональный тирозинсодержащий мотив ICOS YMFM (рис. 3) взаимодействует с регуляторной субъединицей PI3K p50α, что приводит к более сильной активации PI3K по сравнению с эффектом CD28 [21]. В результате стимуляция ICOS приводит к фосфорилированию киназ AKT, PDK1, ERK1/2, p38 MAPK и активации транскрипционных факторов NFAT и NF-ϰB, что отличает ICOS от CD28, который также вовлекает в сигнальный каскад киназу JNK и активирует транскрипционный фактор c-Jun [17].

Функциональную активность CAR-T-клеток на основе ICOS первыми показали Shen и соавт., которые применили CAR-T-клетки в лечении глиобластомы в мышиной модели [22]. Предполагается, что именно поляризация CD4+ CAR-Т-клеток в сторону Th1 и Th17 за счет вовлечения PI3K/AKT, p38 MAPK (и других механизмов) усиливает их персистенцию [23], что повышает противоопухолевую активность и CD8+ CAR-T-клеток [23]. Перед введением животным CD4+ mesoCAR-T-клеток, нацеленных на мезотелин, Wyatt и соавт. проводили низкоинтенсивную стимуляцию этих клеток с помощью магнитных шариков, покрытых антителами к CD3 и ICOS (соотношение шарики : клетки = 1 : 10), параллельно добиваясь поляризации клеток в Th17 с помощью коктейля цитокинов. Такая обработка обеспечивала (по сравнению со стимуляцией CD3 и CD28) получение менее дифференцированных CD4+ CAR-T-клеток и сдвиг их метаболизма в сторону окислительного фосфорилирования, что характерно для Т-клеток памяти (Tm – memory T cell). Это подчеркивает преимущество именно ICOS-направленной стимуляции CD4+ mesoCAR-Т-клеток. Такая подготовка приводила к более эффективной элиминации опухоли у мышей с мезотелиомой с помощью комбинации CD4+ Th17 mesoCAR-T-клеток и CD8+ mesoCAR-T-клеток [24] по сравнению со стандартно активированными CAR-T-клетками. Эти данные подчеркивают неодинаковую роль разных костимуляторов в зависимости от типа CAR-Т-клеток – CD4+ или CD8+. Оптимальная костимуляция может быть обеспечена с помощью модификации CD4+ и CD8+ Т-клеток генами CAR с разными костимулирующими доменами, что необходимо учитывать для получения наиболее эффективного CAR-T-клеточного продукта. Исследование эффекта костимуляции CAR-T-клеток с помощью ICOS показало, что замена YMFM на FMFM приводит к нарушению костимуляции CAR-T-клеток через ICOS. Это ведет к низкой секреции указанных ранее цитокинов CAR-T-клетками [25]. Модификации ICD ICOS, повышающие его эффективность, пока не описаны.

Суперсемейство рецепторов фактора некроза опухоли

В состав этого обширного суперсемейства входит порядка 30 рецепторов, которые делятся на три группы: рецепторы, связывающие факторы, ассоциированные с рецептором фактора некроза опухоли (TRAF – TNF receptor-associated factor) (1); рецепторы смерти (2) и молекулы с нефункциональным ICD или без него (3) [26]. В структуре CAR к этому моменту использовали внутриклеточные части только рецепторов группы (1) – это 4-1BB, OX40, CD27, HVEM, TNFRSF18. Консервативные мотивы рецепторов этой группы включают TRAF-связывающие (P/A/S/T)X(E/Q)E и PXQXXD (X – любая АК) [27].

4-1BB. 4-1BB очень часто включают в CAR при создании CAR-T-клеточных препаратов. Четыре из шести одобренных CAR-T-клеточных продуктов содержат в составе CAR именно 4-1BB [2]. Это не случайно, так как 4-1BB – это один из ключевых маркеров активации Т-клеток, который, благодаря взаимодействию с лигандом 4-1BBL и привлечению разных TRAF, инициирует сигнальные пути p38 MAPK, AKT и ERK. Это приводит к активации транскрипции с NF-ϰB-зависимых промоторов, что повышает продукцию сурвивина, Bcl-XL, Bfl-1, Bcl-2 и снижает уровень Bim [28, 29]. Кроме того, сигнал от 4-1BB увеличивает количество митохондрий и трансмембранный потенциал, что усиливает аэробные процессы в Т-клетках, повышая их эффекторные функции [30]. TRAF-связывающие мотивы 4-1BB – это QEED и EEEE (рис. 3), с которыми взаимодействуют TRAF1, TRAF2, TRAF3 и TRAF5 [31].

Включение 4-1BB в структуру CAR увеличивает персистенцию CAR-T-клеток, которые фенотипически становятся очень похожими на Т-клетки центральной памяти (Tcm – central memory T cell). Они слабо экспонируют на своей поверхности один из наиболее характерных маркеров истощения Т-клеток – PD-1 [32, 33]. Отчасти это объясняет характер метаболизма клеток, который при костимуляции через 4-1BB смещается в сторону усиления митохондриальных процессов и повышенного синтеза митохондрий. Кроме того, в клетках, CAR которых содержат 4-1BB, экспрессия генов антиапоптотических факторов повышена, а проапоптотических снижена. В то же время CAR-T-клетки слабее активируются при костимуляции 4-1BB, чем CD28 [34]. Это объясняется привлечением тандема фосфатаз THEMIS-SHP1, который формирует комплекс с 4-1BB за счет мотива из 10 АК на C-конце 4-1BB. Образующийся комплекс препятствует фосфорилированию сигнального домена CAR – CD3ζ. Мутации в QEED и EEEE снижают секрецию цитокинов, долю Tcm-клеток и противоопухолевую активность CAR-T-клеток [25, 35]. Однако опубликованы данные, согласно которым включение 4-1BB в состав CAR приводит к повышенной агрегации CAR-T-клеток, что снижает их жизнеспособность [36]. Примечательно, что удаление упомянутых 10 АК с C-конца 4-1BB в этом случае препятствует агрегации и восстанавливает функциональность CAR-T-клеток. Кроме того, установлено, что 4-1BB индуцирует тонический сигналинг, который способствует апоптозу CAR-T-клеток [37]. Снижение продукции таких CAR позволяет нормализовать активность CAR-T-клеток.

OX40. OX40 – это костимулирующий рецептор, который появляется на поверхности Тn-клеток только после их активации. Связывание ОХ40 со своим лигандом OX40L обеспечивает привлечение TRAF2, 3, 5 через мотив PIQEE (рис. 3) [38, 39]. Адаптеры TRAF2, 3, 5 индуцируют сигнальный путь NF-ϰB, который способствует синтезу в клетках антиапоптотических факторов Bcl-XL и Bfl-1 [40]. Активируются также киназы PI3K/AKT, вовлеченные в синтез сурвивина и киназы Аврора B, что ингибирует апоптоз и способствует пролиферации T-клеток [41, 42].

Костимуляция CAR-T-клеток второго поколения через OX40 способствует более длительной их персистенции по сравнению с клетками, в которых за костимуляцию в CAR отвечают CD28 и 4-1BB. При этом противоопухолевая активность CAR-T-клеток in vivo практически не зависит от костимулирующего домена CAR. In vitro CAR-T-клетки, в которых за костимуляцию отвечает OX40, лучше убивают таргетные клетки [43]. Транскриптомный анализ таких CAR-T-клеток выявил в них повышенную экспрессию генов, ответственных за репарацию ДНК, окислительное фосфорилирование, ингибирование апоптоза, дифференцировку в клетки памяти и пролиферацию. Данные о так называемой «специализации» OX40 и 4-1BB показывают, что 4-1BB преимущественно стимулирует формирование CD8+ Тm-клеток, а OX40 – CD4+ Tm-клеток [39]. Вместе с информацией о том, что ICOS способствует дифференцировке CD4+ Т-клеток в эффекторы типа Th1, Th2 и Th17, это, по-видимому, свидетельствует о том, что наиболее рациональная комбинация для костимуляции CD4+ CAR-T-клеток включает ICOS и OX40. В то же время комбинация CD28 и 4-1BB, возможно, будет более подходящим вариантом для костимуляции CD8+ CAR-T-клеток.

CD27. CD27 связывает лиганд CD70 и способствует пролиферации и дифференцировке Т-клеток за счет активации сигнальных путей NF-ϰB, PI3K/AKT, SAPK/JNK [44, 45]. Стимуляция через CD27 приводит к уменьшению количества FasL в CD4+ Т-клетках и повышению Bcl-XL и Pim-1 в CD8+ Т-клетках, что ингибирует апоптоз и способствует гликолизу в CD8+ Т-клетках [46–48]. Тем самым CD27 поддерживает пролиферацию и жизнеспособность эффекторных Т-клеток и формирование пула Tm-клеток на стадии первичной активации Tn-клеток, во время клональной экспансии и на эффекторной стадии (например, в опухоли). Для взаимодействия с TRAF2, 3, 5 CD27 использует функциональный мотив PIQED(YR) и, возможно, EEEG (рис. 3) [45, 49]. Уникальное свойство CD27, отличающее его от представителей семейства TNFRSF, – формирование гомодимеров за счет дисульфидных мостиков [49]. Именно в этой форме CD27 присутствует на поверхности покоящихся Т-клеток, в то время как их продолжительная активация повышает долю мономерной формы, что, вероятно, защищает Т-клетки от включения костимуляторов при спонтанной активации.

Изучение костимулирующего потенциала CD27 показало, что CD27 CAR-T-клетки способны более эффективно уничтожать опухоли, подобно тому, как это делают CAR-T-клетки с костимуляторами CD28 или 4-1BB, чем CAR-T-клетки первого поколения. Продолжительность персистенции CAR-T-клеток c костимулятором CD27 сходна с персистенцией CAR-T-клеток с костимулятором 4-1BB [50, 51]. В то же время прямое сравнение способности CAR-T-клеток второго поколения с 4-1BB или CD27 элиминировать солидную опухоль у мышей выявило более высокую противоопухолевую активность именно CAR-T-клеток с CD27 [52]. Наиболее эффективной оказалась комбинация сразу трех костимулирующих доменов – CD28, 4-1BB и CD27 – в составе CAR, что усилило пролиферацию, повысило устойчивость клеток к потере CAR, ослабило истощение CAR-T-клеток по сравнению с костимуляцией одним или двумя доменами [53, 54].

HVEM. Аббревиатура HVEM расшифровывается как Herpes Virus Entry Mediator, или медиатор проникновения вируса герпеса, так как первоначально эта молекула была открыта в качестве рецептора вируса простого герпеса-1 [55]. HVEM – это довольно необычный представитель своего суперсемейства, так как он связывает и молекулы, относящиеся к семейству TNFSF – TNFSF14 и лимфотоксин-α, и иммуноглобулин-подобные молекулы – CD272 и CD160 [56]. При этом HVEM костимулирует Т-клетки при транс-взаимодействиях, в то время как цис-взаимодействие препятствует костимуляции, формируя изолированный от других взаимодействий комплекс HVEM с CD272 или CD160 [57]. При активации HVEM связывает TRAF1, 2, 3, 5, что активирует передачу сигнала по путям NF-ϰB, JNK/AP-1 и PI3K/AKT и приводит к повышению синтеза как различных цитокинов, так и Bcl-2 [58, 59]. Это усиливает эффекторные свойства, пролиферацию и жизнеспособность Т-клеток. Молекулы TRAF, как предполагают, взаимодействуют с HVEM за счет мотива VTTVAVEET (рис. 3), который частично соответствует консервативному мотиву (P/A/S/T)X(E/Q)E [58].

Потенциал HVEM-зависимой костимуляции CAR-T-клеток оценили сравнительно недавно [60, 61]. Показано, что HVEM сочетает свойства рецепторов суперсемейств IgSF и TNFRSF. Так, если CD28 обеспечивает преимущественную дифференцировку модифицированных клеток в Т-клетки эффекторной памяти (Tem – effector memory T cell), а 4-1BB – в Tcm-клетки, то HVEM приводит к формированию сбалансированной популяции с практически одинаковыми долями как Tcm-, так и Tem-клеток. Кроме того, если костимуляция через CD28 активирует в основном гликолитический метаболизм, а через 4-1BB – окислительное фосфорилирование, то HVEM усиливает оба метаболических пути, формируя наиболее эффективное функциональное состояние CAR-T-клеток. Вовлечение в костимуляцию HVEM также способствует наименьшему истощению CAR-T-клеток по сравнению с CD28 и 4-1BB. CAR-T-клетки с HVEM показали наибольшую эффективность в случае солидных опухолей у мышей [61]. Кроме того, одновременная продукция CAR и лиганда HVEM TNFSF14 способствует проникновению CAR-T-клеток в опухоль за счет интенсивной секреции хемокинов [62].

TNFRSF18. TNFRSF18, больше известный как GITR (glucocorticoid-induced TNFR-related protein), конститутивно присутствует на низком уровне на мембране покоящихся Т-клеток. При активации уровень GITR на поверхности Т-клеток существенно возрастает. Уровень GITR в Тreg-клетках выше, чем в обычных Т-клетках, даже без стимуляции [63]. Взаимодействие GITR с лигандом GITRL ослабляет иммуносупрессивную активность Treg-клеток, а в эффекторных Т-клетках стимулирует пролиферацию и секрецию цитокинов, оказывает антиапоптотический эффект [64, 65]. Внутриклеточный сигналинг от GITR включает взаимодействие с TRAF1, 2, 3, 5 за счет мотивов STED и PEEE (рис. 3) [66]. Показано, что стимуляция T-клеток антителами к CD3, CD28 и GITR вызывает как сходные реакции, которые приводят к сигнальному синергизму в случае костимуляции, так и индивидуальные эффекты (например, стимуляция GITR вызывает усиленную продукцию ИЛ-27) [67]. Основные сигнальные пути, задействованные в костимуляции через GITR, – это NF-ϰB и MAPK [63].

Показано, что CAR-T-клетки, костимулированные через GITR, по эффективности уничтожения опухолей сравнимы с CAR-T-клетками на основе CD28 и 4-1BB [68, 69]. Кроме того, дополнительная продукция GITRL на CAR-T-клетках усиливает секрецию цитокинов, инфильтрацию опухолей и противоопухолевую активность [70].

Что касается других представителей TNFRSF, то появились работы по включению в состав CAR новых костимулирующих доменов рецепторов этого суперсемейства, например BAFF-R, CD30 и CD40 [35, 71, 72]. Костимуляция через CD40, как показано, ведет к более сильной активации пути NF-ϰB, чем костимуляция через 4-1BB, что может способствовать лучшей персистенции CD40 CAR-T-клеток in vivo.

Остальные костимулирующие домены

Костимулирующие молекулы, не входящие в суперсемейства иммуноглобулинов и рецепторов TNF, привлекают все большее внимание, так как интерес постепенно переключается на сигнальные процессы, происходящие в других иммунных клетках, таких как естественные киллеры, макрофаги и другие. Среди перспективных сигнальных молекул можно выделить Dap10 [73] и дектин-1 [74]. Современные технологии генной и клеточной инженерии позволяют достаточно легко создать библиотеки CAR с различными сочетаниями костимулирующих рецепторов или их частей [71, 75]. В сочетании с высокопроизводительным секвенированием это позволяет глубже оценить эффекты различных костимуляторов, не ограничиваясь наиболее изученными представителями семейств IgSF и TNFRSF, а также подобрать конкретные сочетания костимуляторов, ориентируясь на тип Т-клеток – CD4+ или CD8+.

СИГНАЛЬНЫЙ ДОМЕН CD3ζ И ЕГО АНАЛОГИ

На заре разработки в качестве сигнального домена в структуре CAR использовали только внутриклеточную часть CD3ζ [76, 77]. Это связано с концепцией самого рецептора, которая основывалась на комбинации B- и T-клеточных рецепторов для таргетного распознавания антигенов и последующей активации Т-клетки. Так, ранние исследования показали, что ICD CD3ζ подходит для активации Т-клеток, что заложило основу для конструирования CAR [78]. CD3ζ прочно «укоренился» в структуре рецептора и «кочевал» из поколения в поколение, обеспечивая основной сигнал активации для CAR-T-клеток [79]. Все одобренные к клиническому применению CAR-T-клеточные препараты несут в составе CAR именно CD3ζ (рис. 2), что подчеркивает важность этого домена для разработчиков и, как казалось до недавнего времени, отсутствие альтернатив [5].

Остальные белки группы CD3

Однако интерес к этой части CAR значительно повысился со временем. Так, в 2018 году Sadelain и соавт. показали, что для полноценного функционирования CAR в CD3ζ достаточно оставить один активный иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив (ITAM – immunoreceptor tyrosine-based activation motif) из трех [80]. Важную роль при этом играет как его расположение, так и аминокислотный состав. Наиболее функциональным вариантом для элиминирования опухолей оказался 1XX (1 – позиция активного ITAM относительно мембраны клетки, X – неактивный ITAM), в то время как XX3 умеренно поддерживал персистенцию CAR-T-клеток. Эти данные подчеркнули, что необходимо пересмотреть отношение к казалось бы незаменимому CD3ζ.

В результате были проведены исследования возможных аналогов CD3ζ, а именно, других представителей группы CD3 – ε, δ, γ [81, 82]. В отличие от CD3ζ, эти молекулы в ICD содержат только один ITAM [83]. Хотя все ITAM содержат консервативную последовательность YXXL/I-X6–8-YXXL/I (X – любая АК), состав АК каждого ITAM уникален, что определяет различия в аффинности связывания сигнальных молекул (рис. 4) [84].

 

Рис. 4. Структура и функциональные особенности белков группы CD3. Показана организация внутриклеточных доменов CD3ε, δ, ζ, γ, которые содержат уникальные мотивы для взаимодействия с внутриклеточными сигнальными партнерами. ζ, γ, δ, ε – представители группы CD3 Т-клеточного рецептора; ITAM – иммунорецепторный тирозиновый активирующий мотив; BRS – участок, богатый основными аминокислотами; PRS – участок, богатый пролином; RK – мотив рецепторной киназы; LL – серинзависимый дилейциновый мотив (* указывает на отсутствие серина перед LL, что снижает вовлечение LL в регуляцию Т-клеточного рецептора); ТКР – Т-клеточный рецептор; α, β – распознающие цепи Т-клеточного рецептора; КМ – клеточная мембрана; Y – тирозин; pY – фосфорилированный тирозин

 

Всего мультисубъединичный комплекс ТКР–CD3 содержит 10 ITAM. Высокая концентрация тирозиновых мотивов, вероятно, способствует усилению сигнала, поскольку уменьшение их числа приводит к нарушению функции комплекса ТКР–CD3 у мышей [85]. Кроме того, различия между CD3 и ITAM, содержащихся в них, также важно для передачи сигнала и развития зрелых Т-клеток [86].

Помимо уникальных аминокислотных последовательностей в ITAM, внутриклеточные части каждой субъединицы CD3 имеют свои особенности (рис. 4). CD3ζ и CD3ε содержат участки, обогащенные положительно заряженными АК (BRS – basic-rich stretch), с помощью которых взаимодействуют с внутренней стороной клеточной мембраны [87, 88]. CD3ε взаимодействует с киназой LCK либо через ионные связи между BRS и кислыми остатками в уникальном домене LCK, либо с помощью мотива рецепторной киназы (RK – receptor kinase) и SH3-домена LCK [89, 90]. CD3ε также содержит богатую пролином последовательность (PRS – proline-rich sequence), которая взаимодействует с адаптерным белком NCK, что необходимо для созревания ИС и активации Т-клеток [91]. В CD3γ присутствует проксимальный серинзависимый дилейциновый (SDKQTLL) мотив, который участвует в уменьшении количества ТКР на мембране клетки посредством механизма, зависимого от протеинкиназы C (PKC – protein kinase C) [92]. В CD3δ, кроме ITAM, также есть похожий мотив (ADTQALL), в котором, однако, отсутствует серин, требующийся для взаимодействия с PKC, поэтому CD3δ считается менее значимым для регуляции количества ТКР на мембране в отличие от CD3γ [93].

Уникальные мотивы в структуре каждого представителя белков CD3 играют важную роль в контексте CAR, хотя каждый вариант CD3 по отдельности может быть достаточным для создания функциональной структуры CAR. Это показано путем включения CD3ε, δ или γ в структуру CAR в качестве сигнального домена вместо CD3ζ [81, 82]. Обнаружено, что CD3δ, CD3ε или CD3γ CAR-T-клетки более эффективно элиминируют опухоли in vivo по сравнению с CD3ζ. Это связано с уникальными особенностями конкретных представителей группы CD3. Так, ICD CD3ε связывает киназу CSK, которая ингибирует активацию киназы LCK, что снижает истощение CAR-T-клеток и способствует их персистенции; монофосфорилированный по второму тирозину ICD CD3δ связывает фосфатазу SHP-1, что также снижает интенсивность сигналинга и секрецию цитокинов, вероятно, за счет ослабления активации пути NF-ϰB. Результаты транскриптомного анализа свидетельствуют о снижении экспрессии генов, продукты которых участвуют в гликолизе, повышении экспрессии генов, продукты которых вовлечены в митохондриальный метаболизм, что характеризует фенотип Tm-клеток. Кроме того, в случае CD3δ интенсивно экспрессируется TCF-1, ассоциированный со стволовыми T-клетками памяти [94]. Клетки этого типа, наряду с Tn-клетками, обладают наибольшим потенциалом к самообновлению и способны дифференцироваться в любой тип клеток памяти [95]. Также, вероятно, CD3ε, который обладает большим соотношением положительно заряженных и кислых АК, связывается с мембранными фосфолипидами с более высокой интенсивностью, чем CD3ζ, снижая доступность CAR для внутриклеточных сигнальных партнеров, что наблюдается в случае ТКР и других белков [88, 96]. Это, в свою очередь, снижает вероятность возникновения неспецифического и тонического сигналинга. За счет использования в структуре CAR шарнирного домена из CD8α, способного к димеризации, удалось также показать, что димерные формы CD3δ и CD3γ усиливают секрецию цитокинов CAR-T-клетками, а также количество поверхностных CD69 и 4-1BB, особенно в случае мутации дилейциновых мотивов (SDKQTAL и ADTQAAL) [81].

Сигнальные партнеры ТКР

Новый формат CAR, названных bypassCAR (bCAR), появился благодаря изучению отдельных элементов сигнальных каскадов при активации ТКР. В структуру bCAR были интегрированы части внутриклеточных сигнальных партнеров ТКР вместо доменов, содержащих ITAM. Первые bCAR-подобные химерные молекулы были созданы в конце прошлого века для определения ключевых киназ, необходимых для активации T-клеток [97]. В структуре таких рецепторов CD16 использовали в сочетании с LCK, FYN, SYK или ZAP70. При этом только в случае домена SYK модифицированные клетки могли лизировать клетки-мишени в ответ на стимуляцию. При замене CD16 на scFv к соответствующему антигену сохранялась уникальная способность SYK активировать bCAR-T-клетку, минуя ТКР [98].

Позднее была сконструирована панель противоопухолевых bCAR с CSK, FYN, киназным доменом ZAP70 (ZAP70KD – ZAP70 kinase domain), LAT, SLP76 или PLCγ1 без костимулирующих доменов [99]. bCAR на основе ZAP70KD и PLCγ1 активировали модифицированные T-клетки, хотя PLCγ1 bCAR экспрессировался значительно слабее. В in vivo экспериментах ZAP70KD bCAR-T-клетки эффективнее элиминировали солидную опухоль, чем CD3ζ CAR-T-клетки с костимулирующим доменом 4-1BB. bCAR на основе ZAP70KD активировал T-клетки с нокаутом ТКР и LCK, но не в отсутствие SLP76 или LAT, что подтверждает сохранение структуры сигнальных путей после ТКР.

Недавно были разработаны bCAR второго поколения, где дополнительно встроили адаптерный домен из LAT или SLP76 по аналогии с костимулирующими доменами традиционных CAR. Однако Т-клетки, модифицированные такими конструкциями, обладали чрезмерно высоким уровнем тонического сигналинга [100]. При этом добавление сигнального домена CD28 перед киназным доменом ZAP70 привело к более длительной ремиссии B-клеточной опухоли у мышей под действием bCAR-T-клеток по сравнению с традиционными CAR-T-клетками второго поколения с CD3ζ и костимулирующим доменом CD28.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование комбинаций костимулирующих и сигнальных доменов CAR – это динамично развивающееся направление изучения механизмов функционирования CAR-T-клеток и расширения возможностей применения этих клеток. Разнообразие этих доменов открывает широкие возможности для конструирования CAR-T-клеток нового поколения с улучшенными функциональными характеристиками.

Анализ накопленных данных демонстрирует, что выбор того или иного костимулирующего домена оказывает значительное влияние не только на активацию и цитотоксическую активность CAR-T-клеток, но и определяет тип их метаболической активности, способность к долговременной персистенции in vivo и устойчивость к функциональному истощению. При этом комбинация различных доменов или создание модульных конструкций может позволить преодолеть ключевые ограничения текущих подходов к созданию терапевтических CAR-T-продуктов и их применения, таких как гетерогенность опухолевых антигенов, иммуносупрессивное микроокружение и ассоциированную с адоптивным переносом токсичность.

Кроме того, существует потребность в уменьшении размера CAR с сохранением функциональности и поиске минимально активной структуры рецептора, что должно благоприятствовать успеху модификации и способствовать повышенной и стабильной продукции рецептора CAR-Т-клетками. Такие исследования тоже ведутся [101].

Дальнейшая оптимизация сигнальных доменов CAR-T-клеток требует не только углубленного понимания молекулярных механизмов активации Т-лимфоцитов, но и применения передовых технологий, включая CRISPR-скрининг, транскриптомику, протеомику и компьютерное моделирование [75, 102–105]. Это позволит создавать персонализированные клеточные продукты, максимально адаптированные к биологии конкретного типа опухоли. Наряду с совершенствованием поколений рецептора и созданием модульных систем [106–108], исследования в этой области могут привести к прорывным терапевтическим решениям, расширяющим спектр применения технологии CAR-T и повышающим ее эффективность при лечении как онкологических, так и, возможно, аутоиммунных и инфекционных заболеваний.

Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования РФ (соглашение № 075-15-2024-536).

Об авторах

Д. В. Волков

ГНЦ Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: ya.wolf.otl@yandex.ru
Россия, Москва, 117997

В. М. Степанова

ГНЦ Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: ya.wolf.otl@yandex.ru
Россия, Москва, 117997

И. А. Ярошевич

ГНЦ Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН; Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: ya.wolf.otl@yandex.ru
Россия, Москва, 117997; Москва 119991

А. Г. Габибов

ГНЦ Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: ya.wolf.otl@yandex.ru
Россия, Москва, 117997

Ю. П. Рубцов

ГНЦ Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Email: ya.wolf.otl@yandex.ru
Россия, Москва, 117997

Список литературы

Дополнительные файлы