Применение различных регуляторов роста при клональном микроразмножении смородины черной (Ribes Nigrum L.)

Полный текст

Метаболические процессы в растительном организме протекают при непосредственном участии эндогенных (природные) регуляторов роста. Изучен механизм действия пяти фитогормонов (ауксин, гиббереллин, цитокинин, абсцизовая кислота и этилен). Ауксин, гиббереллин и цитокинин стимулируют рост и развитие растений, усиливают физиологические и биохимические процессы, абсцизовая кислота и этилен замедляют рост и реакции обмена веществ. [2]

Важный фактор, регулирующий морфогенез в культуре изолированной ткани, – наличие в питательной среде цитокининов и ауксинов. Известно, что черная смородина обладает пониженной реакцией на большинство регуляторов роста.

Цитокинины при клональном микроразмножении растений снимают апикальное доминирование и индуцируют развитие пазушных почек, регулируют рост соматических зародышей и формирование растений, замедляют старение органов и повышают их устойчивость к неблагоприятным условиям внешней среды. [18]

Ауксины участвуют в процессах регенерации при размножении каллусных клеток, образовании придаточных и боковых корней, луковиц, заложении вегетативных почек. Природный ауксин в растениях представлен в виде β-индолил-3-уксусной кислоты (гетероауксин) – ИУК. Для практических целей в сельском хозяйстве часто применяют синтетические ауксины, так как они в растениях не разрушаются ИУК-оксидазой. [23]

Растения смородины черной, культивируемые in vitro на питательной среде с цитокининами, в отличие от других ягодных культур, формируют короткие побеги. [13]

Российские и зарубежные исследователи рекомендуют размножать смородину черную в культуре in vitro, используя в качестве индуктора пролиферации дополнительных побегов цитокинин 6-бензиламинопурин (6-БАП, BAP) концентрацией – 0,5…2,0 мг/л среды. [12, 17, 24, 30, 31]

На этапе введения в культуру лучшие результаты были получены на среде с 6-БАП – 0,5…1,0 мг/л. [6] По данным Л.А. Леонтьевой-Орловой, при клональном микроразмножении смородины черной целесообразно добавлять его в питательную среду. [14] В зависимости от генотипа изучаемого растения можно получить два-пять и более дополнительных микропобегов, сформированных в шарообразный конгломерат. [17]

О.В. Матушкина с соавторами указывают на то, что увеличение концентрации 6-БАП до 2 мг/л вызывало повышение коэффициента размножения по сравнению с контролем (концентрация 6-БАП – 0,5 мг/л), однако это приводило к уменьшению микропобегов и снижению количества растений, пригодных к укоренению. [16]

В исследованиях, проводимых в институте плодоводства Питешти совместно с учеными станции плодоводства Клуж-Напока (Румыния), использовали разные типы эксплантов и наблюдали за скоростью размножения растений в пробирке, процентом укоренения, особенностями акклиматизации. На этапах инициации, размножения и укоренения применяли среду Мурасиге-Скуга (MS), а также Woody Plant Medium (WPM) and Driver & Kunyuki Walnut (DKW). В качестве регуляторов роста тестировали 6-бензиламинопурин (6-БАП), зеатин, тидиазурон (ТДЗ, TDZ) и 2-изопентениладенин (2-iP). Наилучшие результаты были получены при использовании MS и DKW, не содержащих гормоны. После двух месяцев культивирования у микрорастений формировались побеги (до 8 см) с междоузлиями более длинными у основания и короткими в средней и верхушечной частях, крупными листьями ярко-зеленого цвета. Регуляторы роста 6-БАП, тидиазурон, зеатин и 2-iP в различных концентрациях не способствовали разрастанию пазушных побегов, а 6-БАП и тидиазурон приводили к росту очень коротких побегов с прикорневым каллусом и деформированными листьями, непригодных для дальнейшего размножения или акклиматизации. [25]

Известно, что для действия цитокинина необходимо присутствие ауксина. От их соотношения зависит регенерационная способность генотипов. [8] Введение экзогенных ауксинов в состав питательной среды на фоне 6-БАП не способствует усилению процесса морфогенеза. [17]

И.А. Райков с соавторами указывают, что выход жизнеспособных эксплантов возможно увеличить с помощью введения в питательную среду цитокинина из ряда дифенилмочевины – форхлорфенурона N-(2-хлор-4-пиридил)-N´-фенилмочевины, CPPU (0,2 мг/л). Более высокие концентрации CPPU (0,5…1,0 мг/л) вызывали морфологические отклонения эксплантов. Культивирование первичных эксплантов целесообразно проводить на питательной среде, содержащей помимо цитокинина ауксины (ИМК, 0,05 мг/л) и гиббериллины (0,5 мг/л). Применение 6-БАП (0,2…1 мг/л) и тидиазурона (TDZ) (0,05…0,2 мг/л) показало меньшую эффективность размножения. Тидиазурон у многих растений вызывает эффект витрификации. [20, 22]

Согласно исследованиям сербских ученых, для успешного размножения растений в культуре in vitro требуется оптимизация условий на каждом этапе культивирования. Побеги черной смородины сорта Čačanska Crna после создания асептической культуры и образования розеток размножали на базальной среде Мурасиге-Скуга с различным гормональным составом. Отмечено, что побеги, растущие на среде без цитокининов (по 0,1 мг/л IBA и GA₃), были длинными, хорошо развитыми и могли быть субкультивированы узловой трансплантацией (разделение на микрочеренки (верхушки побегов и сегменты стебля с одним узлом) и помещение на тот же носитель), их укореняемость достигла 100% к 28 дню. [31]

D. Ružić и T. Lazić в качестве исходного материала использовали почки с веток, срезанных во время покоя (конец января). Культивировали на среде Мурасиге-Скуга с добавлением N6-бензиладенина (BA), индол-3-масляной кислоты (IBA) и гиббереллиновой (GA₃) в различных концентрациях. В фазе укоренения уменьшали содержание минеральных солей в два раза, добавляли 1,0 мг/л IBA, 0,1 мг/л GA₃ и 1 г/л активного угля. [28]

Активные исследования в области клонального микроразмножения смородины черной проводят в Польше. Ученые сельскохозяйственного университета г. Кракова разработали протокол микроклонального размножения представителей родов Rubus и Ribes spp. Источники эксплантов – верхушки побегов, меристемы и покоящиеся почки. Среда на этапе инициации культуры in vitro – Мурасиге-Скуга, дополненная регуляторами роста (бензиламинопурин – 2,0 мг/л, индолил-3-масляная кислота – 0,5, гиббереллиновая – 0,1 мг/л), микроразмножения – бензиламинопурин (1,0 мг/л), индолил-3-масляная кислота (0,1 мг/л), укоренения – бензиламинопурин (2,0 мг/л) и индолил-3-масляная кислота (5,0 мг/л). [26]

Согласно методическим рекомендациям, разработанным в ФГБНУ ВНИИСПК, для размножения смородины черной целесообразно использовать среду Мурасиге-Скуга с добавлением 6-БАП, концентрацией от 0,2 до 2,0 мг/л в зависимости от пассажа. Культивирование эксплантов в колбах Эрлеймейера позволяет уже с 1-2 пассажа получить побеги, пригодные для укоренения. В качестве индуктора ризогенеза применяют ИМК (1…2 мг/л). [19, 20, 22]

По методике РУП «Институт плодоводства» (Беларусь) среда в 0-1-2-3 пассажах – Мурасиге-Скуга с 6-БАП в 0-1 пассажах и на этапе размножения (2-3) – 0,5 мг/л, элонгации (2-3 пассажи) – 1,0 мг/л. Также на этапах элонгации в состав среды вводили GA₃ – 0,5 мг/л (2 пассаж) и 1 мг/л (3). При такой комбинации постепенно увеличивался коэффициент размножения, получено около 50% побегов, готовых к укоренению.

Среда Андерсона, дополненная 6-БАП (0,5…1,0 мг/л), оказалась подходящей по минеральному составу для развития растений, на Нича-Нича экспланты постепенно погибали. [12]

Л.В. Григорьева и сооавторы в своих опытах использовали два синтетических стимулятора роста из группы цитокининов (цитадеф и кинетин) и одно вещество из ауксинов (гетероауксин). Влияние концентрации регуляторов роста на коэффициент размножения смородины черной определяли на средах: 6-БАП (0,5 мг/л); 6-БАП (1,0 мг/л); ЦФ (цитадеф) 0,5 + ИУК 0,02 мг/л (гетероауксин); ЦФ 1,0 + ИУК 0,02 мг/л. На этапе укоренения ввели два вещества группы ауксинов – гетероауксин (ИУК) и индолил-3-масляную кислоту (ИМК). Наилучшие результаты показала среда Мурасиге-Скуга с добавкой цитадефа (0,5 мг/л) и гетероауксина (0,02 мг/л). Эффективное укоренение побегов смородины черной наблюдали с добавкой гетероауксина концентрацией 1,0 мг/л. [5]

Необходим поиск новых регуляторов роста, так как часто трудно подобрать оптимальное их соотношение вследствие разнокачественности эксплантов. [7]

В последнее время в дополнение к 6-бензиламинопурину для размножения растений in vitro используют метатополин – природный цитокинин, выделенный из листьев Populus × robusta). [27, 29, 32]

В своих исследованиях для микроклонального размножения черной смородины ученые применяли метатополин (0,7 и 1,5 мг/л), но бензиламинопурин оказался эффективнее. [29]

И.В. Князева, В.Н. Сорокопудов, О.А. Сорокопудова отмечают, что для беспересадочного хранения эксплантов в течение трех-четырех месяцев в межсезонный период целесообразно использовать питательную среду Мурасиге-Скуга, дополненную регуляторами роста 6-БАП (0,7 мг/л) и ИМК (1 мг/л), а также источниками углеводов (маннит или сахароза). Для длительного культивирования при комнатной температуре 22…24°С рекомендуется применять маннит пониженной концентрации (0,45%). При среднесрочном депонировании (температура – 3…6°С) оптимальный источник питания – сахароза. [10, 11]

Эффективность технологии микроклонального размножения во многом определяется способностью боковых побегов к укоренению in vitro. Успешность прохождения этапа ризогенеза зависит от культуры, сорта, условий этапа пролиферации, солевого и гормонального состава среды, количества пассажей, степени развития укореняемого экспланта. [7, 21, 22]

Для стимуляции корнеобразования культивируемых растений смородины черной in vitro оптимальные концентрации в питательной среде гормональных веществ ауксиновой природы: ИМК – 0,3…2,5 мг/л, ИУК – 0,5…1,0, ГК₃ – 0,1…1,0 мг/л. Возможно укоренение побегов на среде MS с 6-БАП. Критический размер для укоренения побегов смородины черной – 1…2 см. [4, 9, 16] Корнеобразование ускоряют ИУК (3 мг/л) или ИМК (1 мг/л), но c учетом сортовых особенностей. [1]

И.А. Райков для импульсной обработки неукоренившихся растений предлагает использовать ИМК с концентрацией в растворе от 5 до 5,7 мг/л способом обмакивания с последующей высадкой в субстрат, что увеличит выход укоренившихся растений. [21]

Для успешного укоренения микропобегов черной смородины С.А. Матушкин и Л.В. Ярмоленко рекомендуют среду Кворина-Лепуавра с разбавленным составом (¹/₂ QL), витаминами и хелатом железа. Индуктором ризогенеза служила ИМК (1,0 мг/л). С применением разбавленной среды (¹/₂ MS) была более низкая результативность укоренения микропобегов. [15]

Смородина черная может легко образовывать корни и на безгормональной среде, особенно при использовании крупных растений, поэтому на заключительном этапе культивирования in vitro возможно высаживать микрочеренки на разбавленную вдвое среду без ауксинов, с добавлением витаминно-минерального комплекса Компливит (2 г/л) для усиления ростовых процессов культуры. Но качество посадочного материала может быть неудовлетворительным, образуются единичные тонкие корни каллусного происхождения. [22]

Применяют два способа стимуляции корнеобразования: предварительная обработка микропобегов регуляторами роста с последующим культивированием на безгормональной среде и введение регулятора роста непосредственно в питательную среду для укоренения, при этом стимуляторы рекомендуются только на начальных этапах ризогенеза. [3, 4, 9, 28]

Об авторах

Татьяна Михайловна Хромова

Всероссийский научно-исследовательский институт селекции плодовых культур

Автор, ответственный за переписку.
Email: khromova@orel.vniispk.ru

кандидат биологических наук

Россия, д. Жилина, Орловская область

Лариса Владимировна Ташматова

Всероссийский научно-исследовательский институт селекции плодовых культур

Email: khromova@orel.vniispk.ru

кандидат сельскохозяйственных наук

Россия, д. Жилина, Орловская область

Ольга Владимировна Мацнева

Всероссийский научно-исследовательский институт селекции плодовых культур

Email: khromova@orel.vniispk.ru
Россия, д. Жилина, Орловская область

Список литературы

Дополнительные файлы