Том 20, № 3 (2025)

Прогрессирующая оссифицирующая фибродисплазия — это крайне редкое наследственное заболевание с распространённостью примерно 1 случай на 1,5–2,0 млн человек. Основная причина болезни заключается в мутации гена ACVR1, который кодирует одноименный рецептор, участвующий в регуляции остеогистогенеза. Наиболее распространённый генетический вариант — однонуклеотидная замена 617G>A (R206H, rs121912678), приводящая к замене аминокислоты аргинина на гистидин. Этот вариант наблюдается более чем у 95% всех зарегистрированных пациентов с прогрессирующей оссифицирующей фибродисплазией. Мутация нарушает внутриклеточную передачу сигналов, что приводит к патологическому формированию гетеротопической костной ткани в мышцах, сухожилиях и связках. Клиническая картина заболевания может варьироваться: у некоторых пациентов наблюдаются дополнительные симптомы, предположительно связанные с редкими мутациями в других доменах рецептора ACVR1. Несмотря на активные исследования, точные клетки-предшественники, ответственные за патологический остеогенез, до сих пор не идентифицированы. Учёные предполагают, что в процесс вовлечены несколько типов клеток, включая мезенхимальные стволовые клетки и эндотелиальные клетки. В настоящее время эффективного лечения прогрессирующей оссифицирующей фибродисплазии не существует, что подчёркивает необходимость поиска новых терапевтических мишеней. Перспективным направлением является генная терапия, успешно применяемая при других моногенных заболеваниях. Несколько экспериментальных подходов, включая таргетные ингибиторы сигнального пути ACVR1, находятся на стадии доклинических и клинических испытаний.

Обоснование. Болезнь Вильсона–Коновалова представляет собой редкое аутосомно-рецессивное заболевание, вызванное мутациями в гене ATP7B, который кодирует медь-транспортирующую АТФазу. Нарушение функции этого белка приводит к сбою в выведении меди через желчь, что вызывает её патологическое накопление в гепатоцитах. В настоящее время спектр доступных клеточных моделей для изучения молекулярных основ этой патологии и поиска новых терапевтических подходов значительно ограничен.

Цель. Разработка in vitro модели на основе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека для изучения молекулярных механизмов болезни Вильсона–Коновалова и скрининга терапевтических стратегий.

Методы. Мы создали 2D-клеточную модель на основе клеток дефинитивной эндодермы здорового донора, используя валидированные нами индуцированные плюрипотентные клетки с последующей дифференцировкой индукторами активином А и CHIR99021. Перегрузку медью, характерную для патогенеза болезни Вильсона–Коновалова, имитировали путём внесения экзогенной меди в ростовую среду. Для оценки относительной выживаемости клеток применяли краситель Alamar Blue.

Результаты. Использованная линия индуцированных плюрипотентных стволовых клеток демонстрирует нормальный кариотип; морфологию, характерную для эмбриональных стволовых клеток; экспрессирует маркёры плюрипотентных клеток SOX2, OCT4, TRA-1-60 и SSEA-4 и формирует ткани всех трёх зародышевых листков при спонтанной дифференцировке в эмбриоидных тельцах. Дифференцировка данных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток по предлагаемой методике приводит к получению клеток дефинитивной эндодермы с соответствующей морфологией, которые экспрессируют маркёры SOX17, FOXA2 и ATP7B. Полученная модель демонстрирует чувствительность к перегрузке экзогенной медью с IC₅₀ 197 мкМ.

Заключение. Созданная платформа на основе человеческих клеток дефинитивной эндодермы, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток здорового донора, позволяет моделировать перегрузку меди in vitro, имитируя нарушение клеточного метаболизма при болезни Вильсона–Коновалова. Таким образом, предлагаемая модель может быть использована как для фундаментальных исследований, так и для разработки новых терапевтических подходов.

Обоснование. Введение липополисахарида (LPS) мышам является широко используемой моделью для изучения депрессии, ассоциированной с воспалением. Однако механизмы, лежащие в основе вызываемых LPS изменений в мозге, остаются недостаточно изученными.

Цель. Целью данного исследования было изучение поведенческих, клеточных и молекулярных изменений, индуцированных интервальным введением LPS, в двух ключевых для патогенеза депрессии областях мозга — гиппокампе и префронтальной коре.

Методы. Исследование проведено на взрослых самцах диких мышей (n = 28, возраст 2–3 мес, масса тела 25–35 г), а также на первичных культурах глиальных клеток.

Дизайн эксперимента включал введение LPS в дозе 1 мг/кг (3 инъекции внутрибрюшинно) в два этапа с 7-дневным интервалом. На первом этапе эксперимента оценивали поведенческие показатели, на втором проводили забор тканей (префронтальная кора и целый гиппокамп) для молекулярного и гистологического анализа. Для оценки поведения использовали тест «Открытое поле» (общая активность и тревожность), тест подвешивания за хвост, тест предпочтения сахарозы (ангедония) и Y-образный лабиринт (пространственная рабочая память). Первичные культуры клеток глии инкубировали в присутствии LPS — для индуцирования нейровоспаления и фактора роста фибробластов 2 (fibroblast growth factor, FGF2) — для оценки изменения фенотипа микроглиальных клеток.

Молекулярные и клеточные изменения in vivo и in vitro анализировали с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени и методов иммуногистохимии.

Результаты. Введение LPS вызвало у мышей депрессивно-подобное поведение, включая снижение интереса к гедоническому стимулу, увеличение времени нахождения в неподвижном состоянии, снижение общей двигательной активности и нарушения памяти. Воспалительная реакция сопровождалась повышенной экспрессией провоспалительных цитокинов (TNF-α, IL-1β) в селезёнке и головном мозге, при этом выявлены региональные различия в активации астроцитов и микроглии. У мышей, получавших LPS, наблюдали увеличение экспрессии белка плотных контактов 1 (tight junction protein 1, TJP1), фактора роста эндотелия сосудов A и E-селектина, снижение экспрессии клаудина 3, окклюдина, FGF2 и значительное повышение количества тучных клеток. В обоих отделах мозга отмечалась активация микроглии, сопровождающаяся увеличением доли амёбоидных форм клеток. В гиппокампе выявлены изменения глутаматергической передачи, включая снижение экспрессии глутаматного транспортера GLT-1 и глутаминсинтетазы, что указывает на нарушение механизмов буферизации глутамата. В экспериментах in vitro LPS индуцировал активацию микроглии, которая была нивелирована добавлением FGF2.

Заключение. Нейровоспаление, вызванное введением LPS, по-разному повлияло на гиппокамп и префронтальную кору, при этом гиппокамп демонстрировал бóльшую уязвимость. Обнаруженный нейропротекторный эффект FGF2 в отношении LPS-индуцированной активации микроглии указывает на его потенциальную роль в терапии депрессии, ассоциированной с воспалением.

Обоснование. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) представляют собой уникальные клетки, полученные из эпибласта ранних преимплантационных эмбрионов млекопитающих. Они обладают способностью к неограниченному делению в культуре и сохранению недифференцированного состояния. Потенциал к дифференцировке в любые клеточные типы делает ЭСК важным инструментом в регенеративной медицине. Кроме того, они используются при изучении механизмов эмбрионального развития и моделировании заболеваний. Поддержание плюрипотентности и направленной дифференцировки ЭСК зависит от строго регулируемых клеточных процессов, включая деградацию белков через убиквитин-протеасомную систему. Нарушения в работе убиквитин-протеасомной системы могут приводить к выходу ЭСК из состояния плюрипотентности или к апоптозу. Известно, что регуляторная частица протеасом PA28αβ, состоящая из α- и β-субъединиц, кодируемых генами Psme1 и Psme2, играет ключевую роль в этих процессах, особенно в условиях окислительного стресса. Показано, что на ранних этапах дифференцировки в ЭСК мыши происходит увеличение экспрессии PA28αβ, а нокдаун α-субъединицы приводит к накоплению карбонилированных белков, что указывает на участие PA28αβ в ранних этапах дифференцировки ЭСК. Однако функции PA28αβ в поддержании плюрипотентности ЭСК остаются недостаточно изученными.

Цель. Определить влияние нокаута гена Psme1, кодирующего α-субъединицу регулятора протеасомы PA28αβ, на пролиферацию ЭСК мыши и накопление активных форм кислорода (АФК).

Методы. В исследовании с помощью геномного редактирования была создана линия ЭСК мыши с нокаутом гена Psme1. Способность к дифференцировке in vivo оценивали методом тератомного анализа. Экспрессию маркёров плюрипотентности в ЭСК определяли методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени и иммуноблоттинга. Проведён также анализ клеточной пролиферации и продукции АФК с помощью проточной цитофлуориметрии.

Результаты. Получена линия ЭСК мыши с нокаутом гена Psme1. Анализ экспрессии ключевых маркёров плюрипотентности не выявил статистически значимых различий между контрольными и мутантными ЭСК. Тератомный анализ подтвердил сохранение плюрипотентного статуса ЭСК с нокаутом гена Psme1, продемонстрировав их способность к дифференцировке в производные всех трёх зародышевых листков: эктодерму, мезодерму и энтодерму. При этом скорость пролиферации мутантных ЭСК была снижена по сравнению с контрольными клетками, тогда как уровень АФК оставался неизменным.

Заключение. ЭСК мыши с нокаутом гена Psme1 сохраняют плюрипотентность и способность дифференцироваться в производные всех трёх зародышевых листков in vivo. Хотя нокаут гена α-субъединицы регулятора PA28αβ не изменяет уровень АФК, он приводит к снижению темпов пролиферации, что подчёркивает важную роль PA28αβ в поддержании пролиферативного потенциала ЭСК.