Chromatin dispersion of spermatozoa of stud bulls depending on age

Full Text

Введение.

Уровень воспроизводства стада является одним из основных показателей, отражающих эффективность организационно-экономической деятельности предприятий, занимающихся разведением сельскохозяйственных животных, в частности крупного рогатого скота (Багиров В.А. и др., 2012; Menon A. G. et al., 2011). Важнейшим элементом вспомогательной репродуктивной технологии является искусственное осеменение. Данный метод имеет ряд биологических и экономических преимуществ для животноводства, позволяет рационально использовать генетический материал выдающихся производителей (Абилов А.И. и др., 2014; Некрасов А.А. и др., 2017; Abah KO et al., 2023; Morgan HL et al., 2020). Использование данного метода позволяет осеменить семенем одного производителя несколько тысяч маток. Это привело к значительному росту требований к оценке при отборе племенных быков-производителей. Особое внимание уделяется спермопродукции, получаемой от быков, она должна отвечать действующему ГОСТу (Панина Е.В. и др., 2019; Иолчиев Б.С. и др., 2018; Четвертакова Е.В. и др., 2020). Репродуктивные способности быков-производителей и качество получаемой спермы зависят от комплекса факторов биотического и абиотического характера (Шмидт А.В. и др., 2024; Henning H et al., 2021). Многочисленные исследования в области репродукции свидетельствуют о влиянии возраста самцов на качественные и количественные показатели спермопродукции (Agus A et al., 2018; Науменкова В.А., 2019). Установлено, что с возрастом уменьшается концентрация сперматозоидов в эякуляте, снижается их подвижность, увеличивается частота встречаемости гамет с патологиями (Kipper BH et al., 2017). Исследования ряда авторов показывают, что объём эякулята от полового созревания до зрелого возраста увеличивается, это, по мнению исследователей, обусловлено развитием дополнительных половых желез, увеличением семенников и массы тела животного. Положительная динамика данного показателя продолжается до четырёхлетнего возраста, и с семилетнего возраста происходит снижение качественных и количественных показателей семени (Murphy EM et al., 2018; Vince S et al., 2018). Ряд исследований подтверждает, что взрослые быки обладают преимуществом над молодыми по подвижности сперматозоидов (Konenda MTK et al., 2020). Эксперименты с участием быков старше восьми лет показывают снижение подвижности половых клеток от зрелого к пожилому возрасту (Trevizan JT et al., 2018). В последнее время большое внимание уделяется целостности ДНК сперматозоидов. Полученные данные демонстрируют высокую корреляцию между индексом фрагментации ДНК и идиопатическим бесплодием. Изучение взаимосвязи индекса фрагментации с фертильностью проводится как в медицине, так и в животноводстве. Для некоторых видов установлено пороговое значение степени повреждённости ДНК: для людей допустимый уровень составляет 30 % (Evenson DP et al., 2002), у жеребцов — 28 %, а у свиней — 6 % (Kumaresan A et al., 2020). Этиология связи между уровнем фрагментации ДНК и возрастом самцов пока недостаточно изучена. Понимание механизма репродуктивного старения может позволить более эффективно использовать генетический потенциал высокоценных производителей.

 

Цель исследования.

Изучить степень фрагментации ядерной ДНК в сперматозоидах быков-производителей в зависимости от возраста.

 

Материалы и методы исследования.

Объект исследования. Быки-производители голштинской, симментальской, швицкой, джерсейской пород.

Обслуживание животных и экспериментальные исследования были выполнены в соответствии с инструкциями и рекомендациями нормативных актов: Модельный закон Межпарламентской Ассамблеи государств-участников Содружества Независимых Государств «Об обращении с животными», ст. 20 (постановление МА государств-участников СНГ № 29-17 от 31.10.2007 г.), протоколами Женевской конвенции и принципами надлежащей лабораторной практики (Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ Р 53434-2009). При проведении исследований были предприняты меры для обеспечения минимума страданий животных и уменьшения количества исследуемых опытных образцов.

Схема эксперимента. Материалом для исследования были образцы заморожено-оттаянной спермы быков-производителей (n=64). В исследуемой выборке возраст быков-производителей в среднем составил 53,6 месяцев. Минимальный возраст – 14 месяцев, максимальный – 101,3 месяца. Условия содержания и состав рациона для всех животных были идентичными. Уровень кормления зависел от живой массы производителей. Для проверки гипотезы о влиянии возраста быков на степень фрагментации ДНК в хроматине сперматозоидов от каждой партии криоконсервированного семени рандомным методом отбирали по три пробы.

Оборудование и технические средства. Исследования выполнены с использованием приборной базы лаборатории биологии воспроизведения сельскохозяйственных животных Всероссийского научно-исследовательского института животноводства. Оценку качества спермы проводили с использованием программного обеспечения Argus-CASA (Argus Soft), состоящего из четырёх модулей: подвижность, морфология, жизнеспособность и фрагментация. Для микроскопического изучения исследуемых образцов использовали микроскоп Zeiss Axiostar plus. С целью исключения субъективизма оценку всех параметров проводили с помощью CASA. Для определения морфологии сперматозоидов проводилась окраска препаратов. Дисперсию ДНК в хроматине половых клеток определяли с помощью SCD-теста (sperm chromatin dispersion test).

Статистическая обработка. Для создания базы данных использовали «Microsoft Excel» («Microsoft», США), для статистического анализа – «SPSS v.23.0. Statistics» («IBM», США). Для проверки гипотезы о влиянии различных факторов на индекс фрагментации ДНК в хроматине сперматозоидов применили общую линейную модель – многомерный анализ. Уровень значимости P≤0,05.

 

Результаты исследования.

Быки-производители в зависимости от возраста были распределены на три группы:

• I группа – молодые быки-производители, возраст которых не превышал двух лет;
• II группа – взрослые быки старше двух и моложе пяти лет (возраст составил от двух до пяти лет);
• III группа – быки старше пяти лет.

В I группе средний возраст быков-производителей был 21,8 месяца, во II группе – 48,9 месяца, а в III группе – 74 месяца. Результаты многомерного дисперсионного анализа свидетельствуют о статистически значимом влиянии возраста быков-производителей на содержание прогрессивно подвижных сперматозоидов в заморожено-оттаянном семени (F=4,25, P≤0,05). В заморожено-оттаянном семени взрослых быков-производителей 48,31±1,13 % сперматозоидов имели прямолинейное поступательное движение, что на 12,74 % больше, чем у молодых животных, и на 9,12 % – у быков-производителей III группы. Различия между этими группами и между I и III группами не являются статистически значимыми (рис. 1). Достоверная разница между I и III группами установлена по содержанию сперматозоидов с колебательным и манежным движением. У молодых быков сперматозоидов с таким движением оказалось на 3,95 % больше, чем у быков старше 5 лет. В сравнительном аспекте наибольшее содержание неподвижных сперматозоидов наблюдалось в группе быков-производителей, возраст которых в среднем составил 74 месяца. Содержание неподвижных сперматозоидов в исследуемых образцах данной группы в среднем составило 43,31±1,72 %, что на 5,91 абсолютных процента больше, чем у быков-производителей II группы.

 

Рисунок 1. Содержание сперматозоидов разной категории в зависимости от возраста быков-производителей

Figure 1. Content of spermatozoa of different categories depending on the age of stud bulls

 

В исследуемых образцах частота встречаемости сперматозоидов с анормальной морфологией в среднем составила 5,85±0,4 %, что в три раза меньше допустимой нормы по ГОСТ 26030-2015.

В сравнительном аспекте наибольшее число сперматозоидов с патологиями отдельных сегментов обнаружено в образцах быков-производителей III группы и составило 7,48±0,16 %. Разница между группами по частоте встречаемости патологических сперматозоидов не является статистически значимой.

В исследуемых образцах независимо от возраста в структуре распределения встречаемости патологии в отдельных сегментах достоверная разница в зависимости от возраста между группами не установлена. В среднем, наиболее часто встречается патология в жгутиках половых клеток (табл. 1).

 

Таблица 1. Распределение патологии в сегментах сперматозоидов быков-производителей

Table 1. Distribution of pathology in sperm segments of stud bulls

Сегмент локализации патологии от общего числа сперматозоидов с патологией / Segment of pathology localization from the total number of spermatozoa with pathology	Группы в зависимости от возраста, лет/ Groups depending on age, years
	≤2	2-5	≥5
Головка, % / Head, %	32,18±3,61	30,52±2,18	31,24±2,96
Средняя часть, % / Middle part, %	12,32±1,82	11,57±1,45	11,28±1,63
Жгутик, % / Flagellum, %	54,96±3,54	57,41±4,61	57,01±3,87
Полиморфизм тератозооспермия / Polymorphism teratozoospermia
Головка +средняя часть, %/ Head+ Middle part, %	0,14±0,02	0,11±0,01	0,19±0,02
Головка +жгутик, % / Head+Flagellum, %	0,27±0,01	0,25±0,01	0,22±0,01
Средняя часть+жгутик, % / Middle part + Flagellum, %	0,11±0,01	0,14±0,01	0,05±0,00
Головка+средняя часть +жгутик, % / Head+Middle part+ Flagellum, %	0,02±0,00	-	0,01±0,00

 

Сегмент, в котором наиболее часто встречались аномалии строения во всех группах – это жгутик. На его долю приходится 56,46 % от общего количества сперматозоидов с патологиями.

Патология строения головки сперматозоида имеет особое значение, так как наследственный материал сосредоточен именно в этом сегменте. Существует гипотеза, что одной из многочисленных причин фрагментации ядерной ДНК сперматозоида является деформация головки. В популяции аномальных сперматозоидов на долю патологии этого сегмента приходится 31 %. Минимальное значение установлено в образцах II группы, максимальное – в I группе, разница между группами не является достоверной. Сочетание двух и более патологий встречалось крайне редко, во всех группах оно не превышало 0,27 %.

Методом SCD-теста определяли дисперсию хроматина в сперматозоидах быков-производителей.

В исследуемых выборках уровень фрагментации яДНК в среднем составил 10,44 % с коэффициентом вариации 58,6 %. Максимальный уровень фрагментации яДНК (13,8 %) был обнаружен у быка-производителя в возрасте 16 месяцев, минимальный (1,8 %) – у быка в возрасте 49 месяцев. Результаты дисперсионного анализа опровергают нулевую гипотезу о взаимосвязи между возрастом быков-производителей и степенью фрагментации яДНК.

 

Рисунок 2. Индекс фрагментации яДНК в зависимости от возраста быков-производителей

Figure 2. DNA fragmentation index depending on the age of stud bulls

 

Обсуждение полученных результатов.

Изучение взаимосвязи качественных и количественных показателей спермы быков-производителей с их возрастом показало влияние возраста на морфологию половых клеток. Сила влияния возраста быков на частоту встречаемости патологий в строении головок была равна 24 % (Р≤0,05), а жгутика – 37 % (Р≤0,01). На общее количество патологических форм сперматозоидов пришлось 59 % (Р≤0,001) (Бойко Е.В. и др., 2019). Результаты исследования связи структуры хроматина сперматозоидов с возрастом животных показали, что как у молодых, так и у старых быков были более высокие показатели индекса фрагментации по сравнению с быками 2-7 лет. Научные данные о влиянии возраста на индекс фрагментации ДНК хроматина в сперме быков-производителей противоречивы. Одни авторы сообщают о высокой фрагментации ДНК сперматозоидов взрослых быков, другие, напротив, утверждают, что не обнаружили статистически достоверной разницы по индексу фрагментации ДНК в сперматозоидах в зависимости от возраста быков-производителей (Karabinus DS et al., 1990; Fortes MRS et al., 2012; HallapT et al., 2005). Снижение биологической полноценности спермы с возрастом обусловлено рядом факторов, к которым относятся снижение антиоксидантных свойств спермы и гипофункция половых желёз (Carreira JT et al., 2017). Данные о влиянии возраста на качественные и количественные параметры спермы быков-производителей также носят противоречивый характер.

 

Заключение.

Таким образом, результаты исследований показывают, что возраст быков-производителей оказывает статистически значимое влияние на характер движения и индекс фрагментации ядерной ДНК (яДНК) сперматозоидов.

About the authors

Baylar S. Iolchiev

All-Russian Scientific Research Institute of Breeding

Author for correspondence.
Email: baylar1@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5386-7263

Dr. Sci. (Biology), Leading Researcher

Russian Federation, Moscow region, Lesnye Polyany

Anna V. Schmidt

Peoples' Friendship University of Russia named after Patrice Lumumba

Email: anna74@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-8108-7149

Cand. Sci. (Agriculture), Associate Professor

Russian Federation, Moscow

Olga N. Lukonina

All-Russian Scientific Research Institute of Breeding

Email: lukoninaon@mail.ru
ORCID iD: 0009-0004-5369-6555

Cand. Sci. (Agriculture), Acting Director

Russian Federation, Moscow region, Lesnye Polyany

Tatiana A. Moroz

All-Russian Scientific Research Institute of Breeding

Email: t_moroz_2013@mail.ru

Cand. Sci. (Biology), Senior Researcher

Russian Federation, Moscow region, Lesnye Polyany

Dmitry V. Mashtaler

All-Russian Scientific Research Institute of Breeding

Email: mashtaler-1989@mail.ru

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Moscow region, Lesnye Polyany

Nina A. Kombarova

“Head Center for the Reproduction of Farm Animals”

Email: komnina@list.ru
ORCID iD: 0000-0003-3861-4465

Cand. Sci. (Biology), Chief Technologist

Russian Federation, Bykovo settlement, Podolsk city district, Moscow region

Svetlana N. Ushakova

All-Russian Scientific Research Institute of Breeding

Email: ob-vniiplem@yandex.ru

Cand. Sci. (Biology), Senior Researcher

Russian Federation, Moscow region, Lesnye Polyany

Irina E. Pridanova

All-Russian Scientific Research Institute of Breeding

Email: irinapridanova@yandex.ru

Cand. Sci. (Biology), Senior Researcher

Russian Federation, Moscow region, Lesnye Polyany

References

Supplementary files